МИНИСТЕРСТВО  ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ГРУЗИИ

РЕСПУБЛИКАНСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР

МЕДИЦИНСКОЙ БИОФИЗИКИ И ВНЕДРЕНИЯ НОВЫХ БИОМЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ им. акад. Н.В.КАРСАНОВА

 

 

                                                                                                                        Hа пpавах pукописи

                                                                                                                                    

 

                                                             

САМСОНИДЗЕ  Тенгиз Георгиевич

Text Box: ИЗМЕНЕНИЕ СТРУКТУРНО КОНФОРМАЦИОННОГО СОСТОЯНИЯ ТОНКОЙ НИТИ МИОКАРДА ПРИ НЕДОСТАТОЧНОСТИ СЕРДЦА
 


  

 

                                    

 

03.00.02. -  Биофизика

 

 

Д И С С Е Р Т А Ц И Я

на    соискание  ученой   степени   доктора  биологических  наук

 

                                                                                      Hаучный консультант:

                                                                          заслуженный деятель науки,

                                                                          член-коpp АН Грузии и  РАМH,

                                                                          д.м.н., пpофессоp   H.В.Каpсанов

                                            

 

Тбилиси

2002

ПЕРЕЧЕHЬ СОКРАЩЕHИЙ

АДФ - аденозиндифосфоpная кислота

АМ - актомиозин

АМА - актомиозиновый ансамбль

АМФ - аденозинмонофосфоpная кислота

АПС - алкогольное поражение сердца

АТКМ - атиреозная кардиомиопатия

АТФ - аденозинтpифосфоpная кислота

АТФаза - аденозинтpифосфатаза

ГВМ - гибридное волокно миокарда

ДКМП - дилатационная кардиомиопатия

ДHК - дезоксиpибонуклеиновая кислота

ДСH - додецилсульфат натpия

ДСН ПААГ

ДТТ - дитиотpейтол

кД - килодальтон          

Кp - кpеатин

КФ - кpеатинфосфат

КЭЭМ - коэффициент энергетической активности Мх

МФ - миофибрилла

Мx - митохондрия

HАД - никотинамидадениндинуклеотид

HАДH - никотинамидадениндинуклеотид

- недостаточность сеpдца

ОАИ - острая алкогольная интоксикация

ОИМ - острый инфаркт миокарда

ОКА - окклюзия коpонаpной аpтеpии

ОНС - острая недостаточность сердца

ПААГ - полиакpиламидный гель

ПФ - потенциал фосфоpилиpования

РHК - pибонуклеиновая кислота

РПЭФ - pезонансный пеpенос энеpгии флуоpесценции

С-1 - субфpагмент 1 миозина

С-2 - субфрагмент 2 миозина

СГ - сеpдечные гликозиды

СКБМ - система контрактильных белков миокарда

СР - саpкоплазматический pетикулум

ТАМ - токсико-аллеpгический миокаpдит

ТАМ10дп - ТАМ 10-ти дневной продолжительности

Тм - тpопомиозин

ТММ - тяжелый меpомиозин

Тн - тpопонин

Тн-С - Са-связывающий компонент тpопонина

Тн-I - ингибиpующий компонент тpопонина

Тн-Т - компонент тpопонина, взаимодействующий с тpопомиозином

ФБ - функциональная биосимметрика

ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид

ХНС - хроническая недостаточность сердца

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

ЭМС - электpомеханическое сопpяжение                                 

ЭКГ - электрокардиограмма

 

 

 

 


 

О Г Л А В Л Е H И Е

 

 

Cтр.

 

ВВЕДЕНИЕ  技技技技技技技技技技

7

1.

ОБЗОР   ЛИТЕРАТУРЫ   技技技技技技技

11

1.1.    

Симметрия в природе   技技技技技技技技

11

1.1.1.

Общие принципы симметрии  技技技技技技技

11

1.1.2.

Основы структурной симметрии 技技技技技技

19

1.1.3.

Закон рациональных индексов 技技技技技技技

20

1.1.4.

Виды симметрии   技技技技技技技技技

21

1.1.5.

Элементы внутренней симметрии  技技技技技技

23

1.1.6.

Обобщение принципов симметрии 技技技技技技

25

1.2.

Основы структурного анализа 技技技技技技技

28

1.2.1.

Взаимодействие между излучением и веществом 技技技

28

1.2.2.

Формирование изображения в просвечивающем электронном микроскопе    技技技技技技技技技技

29

1.2.3.

Основы теории дифракции. Дифракция рентгеновских лучей

37

1.2.3.1.

Закон Брэгга  技技技技技技技技技技

38

1.2.3.2.

Аналогия с рассеянием света   技技技技技技技

39

1.2.3.3.

Оптическая дифракционная картина молекулы 技技技

40

1.2.3.4.

Дифракционная картина решетки   技技技技技技

41

1.2.3.5.

Дифракционная картина молекулы в решетке  技技技

43

1.2.3.6.

Рассеяние лучей молекулой и кристаллом 技技技技

46

1.2.3.7.

Взаимодействие между условиями дифракции Лауэ и законом Брегга. Обратная решетка   技技技技技技技

49

1.2.4.

Анализ изображений на электронных микрофотографиях 

50

1.2.5.

Трехмерная реконструкция  技技技技技技技

60

1.3

Строение кардиомиоцита  技技技技技技技技

66

1.4.

Строение исполнительного аппарата, миофибрилл, миокарда

71

1.4.1.

Структура и функция  тонкой  нити  миокарда  技技技

71

1.4.1.1.

Основной сократительный белок тонкой нити  актин   

71

1.4.1.2.

Строение и функция минорных белков тонкой нити тропомиозин-тропонинового комплекса 技技技技技

78

1.4.1.3.

Локализация центров взаимодействия протомеров актиновой нити с миозиновой головкой толстой нити 技技技技

82

1.4.1.4.

Одно, или -двухтяжевое представление (альтернативные модели) тонких нитей   技技技技技技技技

85

1.5.

Механизм генерации силы сокращения и хемомеханического преобразования   энергии  миофибриллами кардиомиоцита

86

1.6

Недостаточность сократительной деятельности сердца   

90

1.6.1.

Некоторые субклеточно-молекулярные представления о меха-низме развития недостаточности сердца при воспалительных поражениях миокарда   技技技技技技技技

98

 

2.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ  ЧАСТЬ   技技技技技

101

2.1.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 技技

101

2.1.1.

Экспериментальный материал 技技技技技技技

101

2.1.2.

Методы исследований. Воспроизведение патологии, получение препаратов для электронной микроскопии 技技技技

101

2.1.2.1.

Острая алкогольная интоксикация и алкогольное поражение сердца  技技技技技技技技技技技技

101

2.1.2.2.

Токсико-аллергический миокардит  技技技技技技

102

2.1.2.3.

Атиреоидная кардиомиопатия  技技技技技技技

102

2.1.2.4.

Получение актина  技技技技技技技技技

102

2.1.2.5.

Получение тонких нитей  技技技技技技技技

103

2.1.2.6.

Получение субфрагмента-1 миозина   技技技技技

104

2.1.2.7.

Гель-электрофорез 技技技技技技技技技

104

2.1.2.8.

Получение Mg-паракристаллов тонких нитей 技技技

104

2.1.2.9.

Статистическая обработка результатов   技技技技技

104

2.1.3.

Электронная микроскопия    技技技技技技技

105

2.1.3.1.

Традиционные методы приготовления препаратов и анализа изображений   技技技技技技技技技技

105

2.1.3.1.1.

Электронная микроскопия низкого разрешения; препарирова-ние, ультратонкие срезы, микроскопия   技技技技技

105

2.1.3.1.2.

Морфометрические исследовангия 技技技技技技

110

2.1.3.1.3.

Приготовление углеродных реплик 技技技技技技

111

2.1.3.1.4.

Приготовление препаратов для электронной микроскопии высокого разрешения и получение микрофотографий  技技

111

2.1.3.1.5.

Оптическая дифракция  技技技技技技技技

113

2.1.3.1.6.

Фильтрация изображения  技技技技技技技技

115

2.1.3.1.7.

Трехмерная реконструкция   技技技技技技技

118

2.1.3.1.8.

Усреднение изображений методом корреляции 技技技

120

2.1.3.2.

Специально разработанные методы приготовления препаратов и анализа изображения  技技技技技技技技

121

2.1.3.2.1.

Приготовление препаратов для электронной микроскопии 

121

2.1.3.2.2.

Линейные измерения микрофотографий 技技技技技

123

2.1.3.2.3.

усреднение оптических дифракционных картин и метод моделей   技技技技技技技技技技技

123

2.1.3.2.4.

Принцип образования паракристаллических структур. Получение искуственных паракристаллов  技技技技

124

2.1.3.2.5.

Вывод уравнения для определения модуля упругости тонких нитей. Поведение тонких нитей в однородном электрическом поле  技技技技技技技技技技技技

153

2.1.3.2.6.

Определение относительной диэлектрической прооницаемости раствора препарата тонких нитей (e)   技技技技技

156

2.2.

РЕЗУЛЬТАТЫ  ИССЛЕДОВАНИЯ 技技技技技

159

2.2.1.

Изменение ултраструктуры кардиомиоцита при алкогольном поражении миокарда 技技技技技技技技技

159

2.2.2.

Параметры структуры нитей Ф-актина нормального и атиреозного миокарда   技技技技技技技技

164

2.2.3.

Структура тонких нитей и протомеров актина нормального миокарда    技技技技技技技技技技技

167

2.2.4.

Структура тонких нитей и протомеров актина миокарда при НС обусловленной токсико аллергическим миокардитом  技技

174

2.2.5.

Структура тонких нитей и протомеров актина миокарда при НС обусловленной  атиреоидной кардиомиопатией技技技

190

2.2.6.

Структура декорированных субфрагментом-1 миозина тонких нитей в норме и при НС    技技技技技技技技

184

2.2.7.

Структура паракристаллов тонких нитей миокарда  技技

191

2.2.8.

Исследование искуственных паракристаллов тонких нитей нормального миокарда и при НС 技技技技技技

203

2.2.9.

Структурные различия и моделирование структурной неста-бильности тонких нитей в норме, и при НС обусловленной ТАМ и АТКМ 技技技技技技技技技技

205

2.2.10.

Динамика изменения диаметра тонких нитей в норме и при недостаточности сердца   技技技技技技技技

215

2.2.11.

Динамика изменения диаметра тонких нитей в норме и при НС в условиях воздействия внешнего электрического поля

220

2.2.12.

Определение модуля упругости и свободной энергии в тонкой нити 技技技技技技技技技技技技

227

2.2.13.

Моделирование конформационной подвижности протомеров актина в тонкой нити нормального миокарда, при НС и после воздействия сердечных гликозидов 技技技技技技

231

2.2.14.

Общее заключение 技技技技技技技技技

237

 

ВЫВОДЫ    技技技技技技技技技技技

243

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ  技技技技技技技

245

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Несмотря на определенные достижения в лечении хронической недостаточности сердца (НС) рациональная ее терапия остается нерешенной проблемой [Ю.Н.Беленков и соавт.,1997; Сowburn et al, 1998; Pouleur, Roussean, 1992].

Несомненно, без познания механизмов развития НС разработка рациональной терапии острой НС  и  хронической НС невозможна. Однако субклеточные и молекулярные механизмы возникновения и развития НС [Colucci, 1997; Feldman et al., 1995; Katz, 1990; Saffitz et al.,1998; Schaper, Hein,1993], как и механизм генерации силы исполнительным аппаратом кардиомиоцита [Walker et al., 1994], остаются тайнами природы.

Широкомасштабные исследования, проведенные в Республиканском НИ центре медицинской биофизики и внедрения новых биомедицинских техноло-гий на субклеточном уровне показали, что в начальном периоде НС при различных заболеваниях сердца ведущую роль играет выраженное снижение интенсивности функционирования системы контрактильных белков, и что последующее присоединение энергетического дефицита и нарушений в системе транспорта кальция [Н.В.Карсанов и соавт., 1988] переводят хроническую НС в ранг рефрактерной. При этом снижение сократительной способности миофиб-рилл обусловлено в первую очередь изменением свойств основного белка тонкой нити, актина, и коррелирует со снижением его полимеризационной способности [Н.В.Карсанов и соавт., 1971, 1985; Karsanov et.al., 1985; 1990].

Результаты описанных опытов приобрели общебиологическое значение. Они продемонстрировали, что поражение только актина (без изменения свойств миозина) ведет к снижению скорости и величины генерируемой силы, и, следо-вательно, в акте сокращения, актин не пассивный стержень [Highsmith, Cook, 1983], по которому движется биологический мотор - миозиновая головка, как это принято считать в классической теории мышечного сокращения, а активная структура. Путь от понимания поломок в кардиомиоците при НС к познанию механизма генерации силы открыл большие возможности в изучении роли индивидуальных сократительных белков в развитии НС и механизме генерации силы. В актине, в его внутреннем домене, при острой и хронической НС проис-ходят посттрансляционные изменения не затрагивающие вторичную структуру белка [Karsanov, Jinchvelashvili, 1990], но ведущие при острой НС и  хроничес-кой НС к изменению физико-химического состояния [Karsanov et.al., 1986].

Особое значение при исследовании биологической подвижности имеют современные методы структурного анализа динамической структуры белков: электронная микроскопия, рентгеноструктурный анализ, малоугловая рентге-новская дифракция и др. Просвечивающая электронная микроскопия высокого разрешения занимает здесь особое место так как дает возможноость исследо-вать объекты в более динамичных условиях, чем, например, рентгеноструктур-ный анализ, хотя последний дает структуру более высокого разрешения. Динамичные условия можно моделировать используя, например, различные среды препарирования, или воздействуя на белки полями разной природы и напряженности в процессе приготовления препаратов для эленктронной микроскропии.

 Настоящая работа завершает определенный этап в этих исследованиях, выводит их на молекулярный уровень и тем самым открывает новые подходы и перспективы в изучении механизмов нарушения сократительной деятельности миокарда при НС.

Задачи исследования.

1.     Методами электронной микроскопии (с применением расчетных методов анализа) исследовать структуру Ф-актина и тонких нитей как из нормальношо миокарда, так и при НС, обусловленной ТАМ и атиреоизной кардиомиопатией.

2.     изучить возможность получения паракристаллов и кристаллоподобных структур из тонких нитей как нормального миокарда, так и при НС. Провести анализ полученных образований расчетными методами анализа микрофотографий, с целью выявления закономерности их построения и выявления общих принципов образования структур такого типа.

3.     Предложить новые методические подходы для исследования биологических объектов на электронном микроскопе позволяющие выявить динамичность их структуры и определить ряд свойственных  им параметров.

4.     Провести анализ динамической структуры тонких нитей из нормального миокарда и при НС, и попытаться смоделировать в них конформацитонную подвижность протомеров актина

Цель исследования. Изучить молекулярные механизмы развития НС и выявить структурно-конформационные нарушения в тонкой нити миокарда на основе проведения ее компьютерной трехмерной реконструкции с примене-нием различных традиционных и нововведенных методов препарирования и обработки микрофотографий для определения динамической структуры биоло-гических макромолекул. Выявить новые возможности электронной микроско-пии высокого разрешения для структурных исследований подобного рода.

Научная новизна. Впервые методами электронной микроскопии высокого разрешения проведен анализ микрофотографий тонких нитей миокарда в норме и при НС и проведена трехмерная реконструкция тонкой и изолированной Ф-актиновой нити миокарда. Проведен анализ динамической структуры тонких нитей миокарда в норме и при НС и получены паракристаллы нового типа, ана-лиз которых выявил новый тип симметрии в тонких нитях миокарда, наличие в них золотого сечения. Предложен новый метод приготовления препаратов для электронной микроскопии, позволивший определить модуль упругости тонкой нити миокарда в поперечном направлении как в норме, так и при НС.

Практическая значимость. Работа вносит большой вклад в понимание биофизических и биохимических основ развития и прогрессирования НС,  в частности, в понимание молекулярного механизма нарушения генерации силы миофибриллами миокарда при НС. Создано новое направление, развитие которого послужит пониманию молекулярной  сущности такой общебиологи-ческой проблемы, как генерация силы сердечной мышцей, молекулярных основ развития НС и разработке рациональной терапии НС.

Апробация работы и публикации. Апробация диссертации состоялась на совместной конференции Республиканского НИ центра медицинской биофи-зики, лаборатории биофизики НИИ экспериментальной и клинической терапии Минздрава РГ. Диссертация рекомендована к публичной защите.

    Основные результаты работы докладывались и обсуждались на Международной конференции Ультраструктурные основы патологии сердца и сосудов (Цхалтубо, 1985), III Симпозиуме советской секции Международного общества по изучению сердца (Баку, 1986), XIII Всесоюзная конференция по электронной микроскопии (Звенигород, 1988), Всесоюзных совещаниях по биологической физике (Ереван, 1988; Тарту, 1989); IX Всесоюзном симпозиуме Биофизика и биохимия биологической подвижности (Тбилиси, 1989), Всесоюзных конференциях по биофизике и биохимии мышечного сокращения (Тбилиси, 1985, 1989; Пущино, 1987), на заседаниях Общества грузинских медицинских биофизиков (1987-1992), International symрosium of 揃iological Motility (Pushino,1994), Всероссийской конференции Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц (Пущино, 1996), Международный симпозиум Физико-химические основы организации биологических систем (Тбилиси, 1996), XIV Всероссийская конференция по электронной микроскопии (Звенигород, 2002)

    По материалам диссертации опубликовано 23 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, глав, посвященных обзору литературы, описанию методов исследования, изложению результатов и их обсуждению, выводов и списка  литературы, включающего   417 источника, опубликованных в Грузии, РФ и  за пределами стран СНГ. Работа изложена на 269 страницах машинописного текста и иллюстрирована 72 рисунками и 16 таблицами.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.       СИММЕТРИЯ В ПРИРОДЕ

1.1.1.     Общие принципы симметрии

Симметрия представляет такую особенность природы, про которую при-нято говорить, что она фундаментальна, охватывает все формы движения и организации материи. Истоки понятия симметрии уходят в глубокую древ-ность. Как говорил В.И.Вернадский Представление о симметрии слагалось в течение десятков, сотен, тысяч поколений. Правильность его проверена коллек-тивным реальным опытом и наблюдением, бытом человечества в разнообраз-нейших природных земных условиях. Этот опыт многих тысяч поколений ясно указывает на глубокую эмпирическую основу этого понятия и ее существова-ния в той материальной среде, в которой жил человек, в биосфере... Переходя к историческому времени, мы видим, что понятие симметрия выросло на изучении живых организмов и живого вещества, в первую очередь человека [В.И.Вернадский, 1965]. Само понятие симметрия связанное с понятием красоты или гармонии, произошло из Древней Греции (Vв до н.э.). Греческое слово simmmetria означает нечто гармоничное, однородное, соразмерное, пропорциональное в объекте, т.е. тот способ согласования многих частей, с помощью которого они объединяются в целое. Пифагору принадлежит бессмертная идея о всеобщей гармонии, лежащей в основе мироздания. Заложенная Пифагором вера в красоту и гармонию природы, построенную на единых математических принципах, вдохновляла величайших ученых нашей планеты от И.Кеплера до А.Эйнштейна.

Существуют два представления о симметрии. Одно из них, идущее от античной культуры, связано с пропорциями, в которых симметрия подразуме-вает такую согласованность отдельных частей, которая объединяет их в единое целое [Г.Вейль, 1969]. Второе, современное представление о симметрии ведет начало с 1872 г, когда немецкий математик Ф.Клейн провозгласил знаменитую Эрлангенскую программу [Ф.Клейн, 1956], в которой симметрия  характери-зует переход объектов в самих себя или друг в друга при осуществлении над ними определенных операций (преобразований симметрии). Само понятие симметрии содержиит в себе два противоречивых момента:

1.     Закономерное движение, а значит изменение объекта или его частей вследствии проведения операций симметрии.

2.     Сохранение объекта или его частей, соответствующих этому движению, а значит изменению.

Понятие симметрии теряет смысл, если мы не имеем дела с движением, например, от правой системы координат к левой. Но это понятие перестает работать и в том случае, когда при таком переходе соответствующий параметр не сохраняется. Только наличие определенной группы движений и однов-ременно сохранение определенных параметров в процессе этих движений дает основание говорить о симметрии [Н.Ф.Овчинников, 1966]. По определению Ю.А.Урманцева (1974) симметрия это категория, обозначающая сохранение признаков П объектов О относительно изменений И. Но поскольку относи-тельно другой совокупности изменений рассматриваемое множество признаков {П} не будет инвариантным, то необходимым дополнением любой симметрии соответствующая ей ассиметрия. Другими словами ассиметрия противопо-ложность симметрии; это категория объединяющая несохранение признаков П объектов О относительно изменений И. Так как относительно любой совокуп-ности изменений {И} существуют инвариантные признаки, то необходимое дополнение любой ассиметрии соответствующая ей симметрия.

Можно выделить аспекты без которых симметрия невозможна [В.Д. Цветков, 1997]:

1.     Объект носитель симметрии; в роли симметричных объектов могут высту-пать вещи, процессы, геометрические фигуры, математические выражения, живые организмы и т.д.

2.     Некоторые признаки величины, свойства, отношения, процессы, явления объекта, которые при преобразованиях симметрии остаются неизменными; их называют инвариантными или инвариантами.

3.     Изменения (объекта), которые оставляют объект тождественным самому себе по инвариантным признакам; такие изменения называются преобра-зованиями симметрии.

4.     Свойство объекта превращаться по выделенным признакам в самого себя после соответствующих его изменений.

Важно подчеркнуть, что инвариант вторичен по отношению к изменению. Покой относителен, движение абсолютно. Поэтому при выявлении инвариан-тов всегда необходимо указывать относительно какого изменения (преобразо-вания, операции, движения) они таковыми являются. Очевидно, что нет смысла называть какую-либо величину инвариантой, не узнав относительно какого преобразования она инвариантна. Итак важнейшей характеристикой симметрии является множество различных преобразований, воспроизводящих данный объект по какому-либо признаку. Само множество подобных преобразований и есть собственно группа симметрии. Другим важнейшим аспектом симметрии наряду с группой преобразований является инвариантность. Только наличие определенной группы преобразований и одновременно постоянство некоторых признаков системы, по отношению к которым эти преобразования происходят, дает основание говорить о симметрии.

В настоящее время известны три фундаментальные симметрии:  1) струк-турная; 2) геометрическая и 3) динамическая [Ю.А.Урманцев, 1974], отличи-тельные особенности которых  состоят в следующем:

Если в качестве О выбрать материальный объект, в качестве П его геометрическую фигуру, то это П вместе с операциями И, совмещаюшими его по фигуре, даст структурную симметрию. Структурная симметрия представляет метод изучения пространственных и пространственно представимых объектов.

Если в определении симметрии в качестве О выбрать пространство М, а в качестве П такие свойства фигур, и такие связанные с фигурами величины, которые остаются неизменными относительно всех взаимнооднозначных отображений М на себя, то соединяя и то и другое, мы получим геометри-ческую симметрию. Выбирая соответствующие П и И можно получить в виде тех или иных симметрий геометрии Евклида, Лобачевского, Римана и др.

Если в определении симметрии в качестве О выбрать процесс или взаимодействие, в качестве П некоторые его свойства, то эти П вместе с сохраняющими их реальными и (или) виртуальными физическими измене-ниями дадут динамическую симметрию.

Выдвижение симметрии на первый план в современной науке вызвано тем, что: Симметрия в широком или узком смысле в зависимости от того, как вы определите значение этого понятия, - является той идеей, посредством которой человек на протяжении веков пытался постичь и создать порядок, красоту и совершенство [Г.Вейль, 1969]. Законы симметрии позволяют выявить простоту в сложном мире хаотичных фактов. Функция, которую несут принципы симметрии, состоит в наделении структурой законов природы или установлении между ними внутренней связи, так же как законы природы устанавливают структуру или взаимосвязь в мире явлений [Е.Вигнер, 1971]. Историческое упорядочение науки по мнению того же Вигнера, связано с тремя фундаментальными категориями естествознания: события, законы природы и принципы симметрии. События являются сырьем для законов природы, законы природы представляют собой, в свою очередь, сырье для принципов симметрии. Иными словами, существует глубокая аналогия между отношением законов природы к явлениям, с одной стороны, и отношением принципов симметрии к законам природы - с другой. Можно сказать, что если законы природы управляют явлениями, то принципы симметрии управляют законами природы.

Выдающийся математик ХХ века Г.Вейль (1969) по этому поводу отме-тил: Всякий раз, когда вам приходится иметь дело с некоторым объектом S, наделенным структурой, попытайтесь определить группу его автоморфизмов, т.е. группу, элементами которой являются преобразования, оставляющие без изменения все структурные отношения. Вы можете рассчитывать на то, что на этом пути вам удастся глубоко проникнуть во внутреннее строение объекта S.

Использование принципа симметрии на границе IXX-XX в.в. позволило получить выдающиеся достижения в различных областях науки. Немецкий математик Ф.Клейн, рассмотревший различные геометрии как инварианты определенных групп преобразований внес существенный вклад в формирова-ние современного понятия симметрии, тесно связанного с инвариантностью и теорией групп. Кристаллографы А.В.Гадолин и Е.С.Федоров создали учение о пространственной симметрии. В физике теоремы Э.Неттер позволили связать пространственно-временную симметрию (инвариантность) уравнений физики с сохранением фундаментальных величин энергии, импульса, количества дви-жения. Новые аспекты физического содержания симметрии в рамках теорико-группового подхода были вскрыты специальной и общей теориями относи-тельности, а также квантовой механикой и квантовой теорией поля.

Для фундаментальной физики основными исходными законами являются законы симметрии, т.е. нахождение инвариантов и соответствующим им груп-пам преобразований. Законы природы не могут существовать без принципов инвариантности [Е.Вигнер, 1971; М.Борн, 1963, 1973]. Найти инвариант в классе объектов значит выявить их общее структурное основание.

Идеи симметрии и нахождение инвариантов в наше время стало прони-кать и в исследования по химиии, биологии и смежные с ними направления науки. Более того использование симметрии и теории групп в биологии по мнению некоторых авторов позволит получить в ней более выдающиеся результаты, чем в физике [Derome, 1977]. К сожалению симметрийный подход к биологическим объектам как методологический прием стал развиваться толь-ко в последнее десятилетие ХХ века. Наиболее глубокое развитие идей биосим-метрии дано в работах Ю.А.Урманцева [Ю.А.Урманцев 1971, 1974, 1978, 1980, Urmantsev 1986], благодаря которым в биологии сформировалось новое направление биосимметрика, изучающая вопросы симметрии, их нарушения, биологические инварианты. Им также была создана теория дисфакторов (дис-симметрирующих факторов) и биологической изомерии на основе которой им была развита универсальная общая теория симметрии. Дисфакторы выявляют такие отличительные особенности и признаки у объектов, которые делают их левыми или правыми [Ю.А.Урманцев, 1968]. Дальнейшее развитие биосим-метрика получила в работах Дуброва [А.П.Дубров, 1987]. Он разработал такое важное направление в биологии и медицине, как ФБ, которая обосновывает вариабельность медико-биологических свойств, параметров и показателей жизнедеятельности человека, животных, растений и микроорганизмов. В пос-ледние годы появились работы [А.Г.Волохонский, 1971, А.П.Дубров, 1987, С.В. Петухов, 1981, Э.М.Сороко, 1984, И.Н.Степанов, 1986, Ю.А.Урманцев, 1971, Urmantsev, 1986], посвященные общим проблемам симметрии живых систем и выявлению симметрии в конкретных биообъектах. В некоторых из этих исследований предствавлена роль особых чисел и безразмерных отношений в организации живого и симметричных преобразованиях живых систем.

Согласно представлениям Урманцева (1974), числа выступают на перед-ний план в самых горячих точках: то при изучении распределения планет в солнечной системе, то при объяснении сущности кода наследственности, то при выводе фундаментальных инвариантов в теоретической физике, то при определении периодической природы музыкального ряда и таблицы Менделе-ева. Отметим, что ряд особых чисел начинается из глубины веков и продол-жается до настоящего времени. История физических безразмерных постоян-ных   b = c/q2 =137,03..., (c скорость света, q заряд электрона,  = h/2ph постоянная Планка) и d = M/m = 1836,15... (M, m масса протона и электрона) насчитывает всего несколько десятилетий, в то время, как о существовании числа  p  знали уже жрецы древнего Египта и Вавилона.

Известно также, что числа e, p в разных комбинациях входят в основные уравнения физики. Так, что можно сформулировать вопрос следующим обра-зом: А случаноли такое совпадение? Почему эти числа являются такими уж вездесущими? Чтобы не впасть наподобие Пифагорийцев в мистику следует проанализировать по возможности максимальное число физических соотноше-ний на предмет выявления их истинного физического смысла с учетом того вида симметрии, который можно применить при описании данной системы. В настоящее время можно сказать, что и среди специалистов-теоретиков, занима-ющихся живыми системами, интерес к особым числам и безразмерным отношениям (в особенности к золотому сечению) несомненно возрастает [А.Г.Волохонский, 1971, А.В.Жирмунский, 1982, В.И.Коробко, 1995, С.В.Пету-хов, 1981, И.А.Рыбин, 1990, А.А.Соколов, 1976, Э.М.Сороко, 1984, Ю.А.Ур-манценв, 1968, В.Д.Цветков, 1993, 1997, Li, 1983, Noordergraaf, 1979, Stahl, 1962, 1965, 1967]. Однако для большинства биологов особые числа и связанные с ними проблемы организации живого вещества все еще остаются на заднем плане, как нечто мистическое.

В последние годы в физике установлено, что набор мировых констант, таких как скорость света, постоянная гравитации и т.д., обладает удивитель-ным свойством. Даже ничтожные их изменения, порядка малых долей про-цента, привели бы к такому изменению характера мирового процесса само-организации, который исключил бы возможность появления во Вселенной структур достаточно стабильных, таких, например, как Солнечная система. При этом была бы исключена возможность появления в их структурах живого вещества.

Теперь представим себе, что возможно изменение хотя бы числа p. Как хорошо известно это ирациональное число соответствует отношению длины окружности к ее диаметру и является стабильным для данного пространства. Но отсюда можно сделать вывод, что изменеие этой величины должно привес-ти к изменению геометрии пространства в котором она описана. Значит здесь мы имеем дело с геометрической симметрией, а описать определенное прост-ранство доолжна соответствующая геометрия (Евклида, Римана, Лобачевского и др.). Кроме того напрашивается важный вывод существование множества разных геометрий, которые будут соответствовать различным пространствам с соответствующими значениями числа p. Другими словами числа e, p, i должны быть инвариантными относительно любых преобразова-ний в границах данного пространства.

Итак для любого, претендующего на фундаментальное, описания системы, или какого либо процесса, прежде всего необходимо определить вид симмет-рии, которому подчинено данное описание (структурная, геометрическая, дина-мическая), а затем внутри данного вида определить группу симметрии. По специфике методов исследований (структурный анализ биологических макро-молекул методами просвечивающей электронной микроскопии) нас в первую очередь интересует структурная симметрия исследуемых объектов. Однако надо учесть, что структура биологических макромолекул по своей природе не может быть статичной, она динамична. Поэтому для полного описания системы необходимо определить и динамическую симметрию объектов, что очень усложняет общую методологию исследований. Здесь следует с самого начала поставить ограничения на методологический подход к общей проблемме, что выразится в очередности рещения общей задачи.

На начальном этапе работы реально можно попытаться определить струк-турную симметрию объектов, а уже потом выявить в ней динамику. Такой подход к поставленной задаче в последнее время является общепринятым, однако, как будет показано ниже, он не всегда оправдан из-за чрезвычайно сильных шумов вызванных динамической структурой биомакромолекул.

Для определения структурной симметрии биомакромолекул необходимо вначале рассмотреть все возможные в них операции симметрии (группы сим-метрии для четвертичной структуры и параметры спирали в случае спиральной симметрии), что и будет рассмотрено в следующей главе.

1.1.2. Основы структурной симметрии

Выяснение симметрии биомакромолекул и их кристаллов составляет первый важный шаг в определении любой молекулярной структуры с помощью таких методов структурного исследования, как дифракция рентгеновских лучей, электронная микроскопия. Так, например, в некоторых удачных случаях анализ симметрии кристалла, знание его плотности и содержания воды позволяет устанавливать, что структура олигомерного белка построена из субъединиц.

Математический вывод конечного числа возможных в кристалле симмет-рических операций представляет значительное достижение математиков IXX века. Это достижение представляется еще более значительным, если учесть, что все эти законы были выдвинуты за много лет до появления возможности их экспериментальной проверки с помощью дифракции рентгеновских лучей.

При исследовании кристаллов естественной, исходной точкой определения их симметрии служит изучение внешних форм кристаллов. Известно, что крис-талл имеет хорошо выраженные ребра и грани, расположение  которых подчи-няется определенным законам. Такие естественно образованные плоские грани следствие послойного периодического расположения молекул в кристалле, которые в свою очередь тоже подчинены законам симметрии. Для анализа типов этого периодического, расположения, введем некоторые определения.

Пространственной решеткой называется такое расположение точек (узлов решетки), при котором каждая точка находится в точно таком же окружении и в такой же ориентации, что и любая другая.

Элементарной ячейкой кристалла называется некоторый основной парал-лелепипед (блок), многократное последовательное повторение которого может заполнить весь объем кристалла. Каждая ячейка содержит полное представле-ние о том единичном элементе, многократным повторением которого строится весь кристалл. Вообще удобно выбирать такую элементарную ячейку, которая имеет возможно более короткие ребра и симметрию, максимально возможную для данного кристалла. Ребра ячейки задаются тремя векторами, которые при-нято обозначать символами а, b и с, а углы между ними  - a, b и g, как показано на рис. 1. Длины осей задаются модулями векторов а, b, с. Эта система осей определяет некоторый объем, любую точку внутри которого можно задать па-раметрами х, у, z, выражающими ее расстояния от заданного начала, изме-ренные параллельно ребрам ячейки и выраженные в долях длин этих ребер.

Симметрически независимая часть ячейки. Если в кристалле есть элементы симметрии (кристаллы, не содержащие симметрии, редки), то в элементарной ячейке будет находиться больше одного одинакового объекта (рис. 2). Симметрически независимая часть ячейки - это основной повторя-ющийся объект, который связан со всеми другими идентичными объектами внутри элементарной ячейки операциями симметрии, а с содержимым других элементарных ячеек - трансляциями  а b  и  с.

1.1.3. Закон рациональных индексов

Естественно, что при оптическом исследовании кристаллов кристаллог-рафы стремились как-то обозначить их грани и связать эти обозначения с некоторой элементарной ячейкой. При конкретном выборе элементарной ячейки оказалось возможным задать плоскость, параллельную грани кристалла и  отсекающую на ребрах элементарной ячейки отрезки a/h, b/k и c/l, где h, k, l - небольшие целые числа называемые миллеровскими индексами грани. Сог-ласно закону рациональных индексов, который является следствием простран-ственно-решеточного строения кристалла, грани кристалла параллельны ука-занным плоскостям. Так, например, форму кубического кристалла можно задать символом {100}; это значит, что куб образован гранями 100, 00, 010, 00, 001 и 00. На рис. 3 показана двумерная решетка и приведены индексы некоторых семейств плоскостей. Например, плоскости 100 отсекают по осям b и с отрезки бесконечной длины, а ось а делят на единичные отрезки. Поэтому они перпендикулярны оси а. Аналогично плоскости 010 перпендикулярны оси b. На рисунке показаны также некоторые плоскости других типов, наклонные к осям а и b. Переход к трем измерениям очевиден.

Хотя можно выбрать плоскости с любыми значениями индексов h, k, l, грани кристалла оказываются параллельными только таким плоскостям, кото-рые имеют небольшие значения индексов, обычно меньше 3. Значения индек-сов граней больше 5 чрезвычайно редки. Это вызвано тем, что грани кристалла представляют плоскости с высокой (хотя и не обязательно с максимально высо-кой) плотностью расположения узлов решетки. Из рис. 3 видно, что, например, плоскости 320 имеют более низкую плотность узлов, чем плоскости 010.

1.1.4. Виды симметрии

Внутри идеального кристалла всегда можно выбрать точку и провести из нее нормали к граням кристалла. Эта группа линий будет характеризовать внешнюю симметрию кристалла. Наблюдая ряд кристаллов и определив направления нормалей к их граням, можно построить идеальный кристалл и установить его внешнюю симметрию.

Возникает вопрос, какие виды элементов симметрии возможны для внешней симметрии кристалла? В математическом смысле требуется найти группу элементов симметрии, при действии которых на любую точку структуры она будет возвращена в свое исходное положение. Эта концепция операции точечной группы симметрии приводит к тридцати двум видам симметрии. Существуют три основных типа операций симметрии:

а) Зеркальная плоскость (m). Отражение в плоскости симметрии. Посколь-ку биологические объекты построены из энантиомерных молекул (например, D-caxapa и L-аминокислоты), этот тип операций симметрии, который перево-дит правую молекулу в левую и наоборот, не может встречаться в кристаллах, биологических соединений.

б) Поворотная ось (х). Поворотная ось порядка х поворачивает объект вокруг себя на 360/х. Так, оси 2-го порядка соответствует поворот на 180, оси 3-го порядка - поворот на 120 и т. д. На типы поворотных осей, встречаю-щихся в кристаллах, накладываются жесткие ограничения. Это вызвано требо-ванием бесконечной периодичности кристалла в трех измерениях. Показано [Buerger, 1963], что угол поворота a может иметь только определенные значения, для которых  cosa = М/2,  где М - положительное или отрицательное целое число и a = 360/x. Таким образом, х может быть равно только 1 (операция идентичности), 2, 3, 4 или 6 и не может принимать никакие другие значения.

Примеры поворотных осей этих типов показаны на рис. 2. Этот рисунок также иллюстрирует взаимосвязь симметрически независимой части ячейки и всей ячейки.

Хотя порядки поворотных осей в кристалле ограничены значениями 1, 2, 3, 4 и 6, это не означает, что природные объекты не могут содержать поворотные оси других порядков, которые, правда, не создают повторяемости в кристал-лической решетке. Например, расположение лепестков многих цветов подчиня-ется симметрии поворотной оси 5-го порядка, сферические вирусы и некоторые радиолярии имеют икосаэдрическую симметрию, а пары оснований ДНК рас-положены по винтовой оси 10-го порядка. Ограничение на поворотные оси просто означает, что ни один из этих объектов не мог бы кристаллизоваться в решетке, в которой лепестки цветка, субъединицы вируса и пары оснований ДНК представляли бы симметрически независимые части ячейки. С другой стороны, если некоторый объект содержит элементы поворотной симметрии, допустимые для кристалла (например, оси 2-го и 3-го порядков), то он может закристаллизоваться так, что его субъединица будет составлять симметрически независимую часть ячейки. В кристаллографии белка это наблюдается доволь-но часто, если сам белок представляет собой олигомер.

в) Инверсионная ось сочетает поворот на определенный угол с инверсией в точке и обозначается в зависимости от поворота , , ,  и . Так, ось  эквивалентна центру симметрии, а ось  - зеркальной плоскости симметрии. Поскольку биологические молекулы энантиомерны, этот вид симметрии не встречается в их кристаллах.

Кроме описанных элементов симметрии, возможны также различные их комбинации, подчиняющиеся определению точечных групп. Полный перечень операций таков:

х

поворотная ось

инверсионная ось ( = т)

х/m

поворотная ось, перпендикулярная плоскости симметрии

хт

поворотная ось с вертикальной плоскостью симметрии

т

инверсионная ось с вертикальной плоскостью симметрии

х2

поворотная ось с перпендикулярной ей двойной осью

х/тт

поворотная ось с вертикальной плоскостью симметрии и перпендикулярной ей плоскостью симметрии

Подставляя поворотные оси конкретных порядков, получим тридцать два вида симметрии. Отметим, что единственные операции, которые потребуются в кристаллографии белка, - это х и х2, так называемые циклическая и диэдричес-кая симметрии.

1.1.5. Элементы внутренней симметрии

Операция точечной группы заключается в том, что все возможные комби-нации элементов симметрии возвращают любую точку структуры в исходное положение. Под внутренней симметрией понимают такой самосогласованный набор операций симметрии, например в кристалле, действие любой из опера-ций которого или трансляций решетки приводит к совпадению всех остальных операций симметрии. Кроме того, имеются две трансляционные операции симметрии:

а) Плоскость скольжения. Структура отражается в плоскости и перено-сится параллельно этой плоскости. Перенос совершается на расстояние, равное половине длины ребра элементарной ячейки. Таким образом, два последова-тельных отражения и переноса эквивалентны одной трансляции элементарной ячейки. В энантиоморфных кристаллах белков плоскости скольжения отсут-ствуют.

б) Винтовые оси. Структура поворачивается на угол, соответствующий порядку оси, и переносится параллельно оси поворота. Для винтовой оси 2-го порядка перенос составляет половину длины ребра элементарной ячейки, параллельного оси вращения; таким образом, и здесь два последовательных применения операции симметрии приводят к совпадению со следующей элементарной ячейкой структуры. Винтовая ось 2-го порядка обозначается 21.


Для винтовой оси 3-го порядка перенос может быть на одну треть (31) или на две трети (32) ребра элементарной ячейки. Структура совмещается сама с собой в следующей ячейке за счет трех таких последовательных операций. Эти операции показаны на рис. 4. Они приводят к двум возможным расположениям повторяющихся мотивов относительно оси вращения: по часовой стрелке и против часовой стрелки. Для винтовой оси 4-го порядка существуют три воз-можности 41, 42 и 43 с переносом соответственно на одну четверть, две четверти и три четверти ребра элементарной ячейки. Возможны следующие винтовые оси 6-го порядка: 61, 62, 63, 64 и 65, с переносом на одну шестую, две шестых, три шестых, четырех шестых и пять шестых соответственно. 

Здесь следует отметить, что спирали могут быть непрерывными и прерывистыми (дискретными), которые представляют систему точек, располо-женных вдоль непрерывной спирали. Естественно, при описании структур спиральных макромолекул следует применять дискретные спирали.

Дискретная спираль может быть охарактеризована следующими периоди-ческими компонентами вдоль главной оси: проекцией  с  расстояния между соседними точками на главную ось z, периодом непрерывной спирали  С  и истинным периодом прерывистой спирали  с (рис. 5). Заметим, что операцией симметрии, приводящей к спиральному расположению точек, является винтовое смещение  sM, состоящее из поворота на y = 2p/M  со сдвигом вдоль оси на с.  При целом  M = p  на один оборот спирали приходится M точек, т.е.  с = C/p , и период непрерывной спирали  С  равен периоду  с  дискретной спирали. Возможен другой случай, когда p точек приходится не на один, а на q оборотов (M = p/q). В этом случае истинный период дискретной спирали  с , т.е. расстояние между трансляционно идентичными ее точками будет определяться соотношениями            c = qC = p с,     C/ с = p/q = M

т.е. он больше периода непрерывной спирали в  q  раз (рис. 5,в). Например для a-спирали  С =0,54 нм,  с =0,15 нм,  т.е. М =18/5, и истинный период с = 2,7 нм. Более подробно к вопросу об особенностях дискретных спиралей при описании реальных структур мы вернемся в последующих главах.

1.1.6. Обобщение принципов симметрии

Если попытаться разделить отрезок на две неравные части соответственно с понятиями гармонии, то обнаружим, что отношение большего отрезка к меньшему равно отношению всей длины к большему отрезку и равно примерно 1,62. Это число, называемое "золотым сечением", наряду с числами  p  и  е  входит в тройку самых известных иррациональных чисел. И, хотя "золотое сечение" и не такое распространенное в математике, как два других, оно имеет важное значение для нашего восприятия мира, так как пропорции, отвечающие "золотому сечению" воспринимаются нами как гармоничные.

"Золотое сечение" было известно древним грекам. Вряд ли можно сомневаться в том, что некоторые древнегреческие архитекторы и скульпторы сознательно использовали его в своих творениях. Примером может служить хотя бы Парфенон. Именно поэтому было предложено называть отношение двух отрезков, образующих "золотое сечение", числом F *.

Известно много замечательных свойств F, проявляющихся в различных плоских и пространственных фигурах. Например, отношение радиуса окруж-ности к стороне правильного вписанного десятиугольника равно F. Далее, располагая три золотых прямоугольника (прямоугольники, стороны которых относятся в золотом соотношении) так, чтобы каждый симметрично пересе-кался с двумя другими (под прямым углом к каждому из них), увидим, что вершины золотых прямоугольников совпадают с 12 вершинами правильного икосаэдра и в то же время указывают положение центров 12 граней правиль-ного додекаэдра.

"Золотой" прямоугольник обладает многими необычными свойствами. При отрезании от "золотого" прямоугольника квадрата, сторона которого равна меньшей стороне прямоугольника, снова получается "золотой" прямоугольник меньших размеров. Продолжая отрезать квадраты, мы будем получать все меньшие и меньшие "золотые" прямоугольники.

Чему же равно F? Вспомним определение: большая часть относится к меньшей как все к большей. Если меньший отрезок принять за единицу, то можно записать пропорцию: , которая сводится к обычному квадрат-ному уравнению   х2 - х - 1 = 0,  положительный корень которого равен . Это число одновременно выражает длину отрезка х и значение величины F. Его десятичное разложение имеет вид 1,61803398 Если за единицу принять больший отрезок, то длина  х  будет выражаться величиной, обратной F, то-есть 1/F. Любопытно, что 1/F = 0,61803398  Число F единственное положительное число, которое переходит в обратное ему при вычитании единицы. Так же, это число тесно связано с метрическими свойствами некоторых правильных многоугольников и многогранников пятиугольника, десятиугольника, додекаэдра, икосаэдра, так как оно равно 2cos(p/5).

Подобно числу p, F можно представить в виде суммы бесконечного ряда многими способами. Например

F =                                    (1.1)

где  j(n) = j(n-1) + j(n-2) представляет собой рекурентное соотношение, определяемое числами Фибоначи j(n).

Число F иррациональное, не представляемое в виде простой дроби. Однако, если воспользоваться приведенной формулой, обрывая дробь на первом, втором, третьем и т.д. члене ряда, то получается ряд дробей, постепен-но, то сверху, то снизу приближающийся к F :   1/1, 2/1, 3/2, 5/3, 8/5, 13/8,

Замечательно, что числа содержащие золотое сечение, сохраняют это свойство как при операции удвоения, вплоть до 2n, так и при логарифми-ровании по основанию 2. На рис. 6. представлены геометрические построения, которые можно сделать с использованием принципов золотого сечения и которые наглядно интерпретируют образование золотой пропорции и чисел Фибоначчи.

Тригонометрические соотношения для представленных треугольников из которых видна их связь с "золотым сечением" описываются соотношениями:

sin 18 = sin== cos 72

sin 30 = sin =  = cos 60

sin 36 = sin = = cos 54

sin 45 = sin =  = cos 45

sin 54 = sin== cos 36 = cos =

1.2. ОСНОВЫ СТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА

1.2.1. Взаимодействие между излучением и веществом

Применение всех оптических приборов, в которых исследуемый объект освещается специальным источником, основано на том, что изменения, кото-рые претерпевает освещающий луч в результате его взаимодействия с объектом исследования, содержат информацию об объекте. Понятие оптический при-бор имеет самый широкий смысл. Имеются в виду все измерительные устройства, в которых первичный волновой пакет падает на объект исследования, безразлично, идет ли речь об электромагнитном излучении (видимый свет, рентгеновское излучение) или о потоке частиц (электронное, протонное, нейтронное излучение). В зависимости от типа изменений говорят об абсорбции, преломлении, рассеянии света, дифракции, интерференции и т. п. Полнота анализа искажений светового потока определяется, во-первых, экспериментальными возможностями и, во-вторых,
целью исследования.

В аппаратуре для анализа рентгеновского излучения, например, отсутствуют линзы (если не учитывать неудачные до сих пор опыты с зонными пластинками). Волновое поле после объекта регистрируют на фотопластинке или записывают счетчиком. В аппаратуре, использующей видимый свет, для создания действительного изображения освещаемого предмета часто применя-ют линзы. В этом случае истолкование изображения вследствие простоты геометрических законов его построения не требует привлечения математичес-кого аппарата. Однако на примере голографии [Boersch H., 1966] было показано, что интерференционная картина (голограмма) содержит большую информацию об объекте, чем его действительное оптическое изображение. Правда, голография связана с определенными свойствами освещающего света (когерентностью излучения).

Вся информация об объекте, которую можно получить, заключается в изменениях, которые претерпевает освещающий пучок в результате отражения от объекта. В общем случае невозможно одновременно воспринять всю инфор-мацию, используя существующие измерительные средства. Поэтому весьма важно сопоставлять результаты исследований, полученных различными мето-дами. Характер доминирующего процесса взаимодействия между волновым излучением и исследуемым объектом определяется главным образом соотноше-нием между длиной волны излучения и размером области местной неоднород-ности в объекте. Если расстояния, на которых характеристические свойства объекта заметно меняются, велики по сравнению с длиной волны, то преобладают процессы абсорбции и преломления, в противном случае имеют место дифракция и рассеяние. Электронные лучи с энергией около 100 кВ обладают длиной волны, которая значительно меньше межатомных расстояний в кристалле (см. рис. 7). На электронномикроскопических объектах эти лучи преимущественно рассеиваются и дифрагируют.

1.2.2. Формирование изображения в просвечивающем электронном микроскопе

В электронном микроскопе имеются электронные линзы, которые, как и линзы для светового излучения, можно описать определенными параметрами, например фокусным расстоянием, апертурой, константами аберраций и т. п. При работе на электронном микроскопе необходимо иметь представление о возможном ходе лучей и о причинах возникновения контраста на изображении объекта, ибо только понимание законов формирования контраста позволяет наилучшим образом использовать возможности прибора и правильно интерпре-
тировать результаты электронномикроскопического исследования.

Все просвечивающие микроскопы (как светооптические, так и электрон-ные) сходны в том смысле, что исследуемый объект освещается пространст-венно когерентным* волновым излучением. При освещении объекта когерентным излучением (рис. 8), вследствие строгой пространственной периодичности последнего на объекте между отдельными пучками, на которые мысленно можно разделить поток излучения, возникают определенные фазовые соотно-шения. Эти соотношения фаз определяются геометрией осветительной системы и оптическим расстоянием между источником излучения и освещаемой точкой объекта. В просвечиваемом объекте в зависимости от изменения свойств от одной его точки к другой лучи более или менее сильно абсорбируются и дифрагируют. Лучи, исходящие из различных точек объекта, отклонены от исходного направления в результате рассеяния или дифракции и благодаря своей когерентности могут интерферировать. Таким образом позади объекта возникает модифицированное волновое поле, которое содержит всю информа-цию об объекте, отвечающую специальным экспериментальным условиям. Распределение энергии излучения, обусловленное дифракцией и интерферен-цией, регистрируется соответствующим приемником (например, фотопластин-кой), помещенным в плоскости, перпендикулярной оптической оси. Получен-ное изображение называется дифракционной картиной объекта.

В микроскопе существует специальная осветительная система, состоящая из источника излучения (в световом микроскопе это лампа, в электронном микроскопе - катодная система) и линзы (конденсора), которая преобразует расходящийся пучок от источника излучения в параллельный. Таким образом, на объект падает плоская волна. Предположим, что оптические свойства объекта периодически изменяются в пространстве. Такой объект для краткости назовем решеткой, причем специфику характера изменения свойств вначале рассматривать не будем. Например, может периодически изменяться коэффи-циент абсорбции, тогда говорят об абсорбционной решетке, если же изменяется коэффициент преломления, то речь идет о фазовой решетке. Представление об объекте как о периодической решетке значительно менее ограниченно, чем это кажется на первый взгляд. В принципе все объекты можно представить как суперпозицию периодических структур (разложение Фурье). В электронной микроскопии это выполняется особенно хорошо, во-первых, вследствие малой апертуры электронных линз, пропускающих почти параллельные лучи, и, во-вторых, потому, что кристаллические объекты сами по себе являются трехмерными точечными решетками.

Для начала рассмотрим простейший случай: решетку из чередующихся прозрачных и непрозрачных полос равной ширины (абсорбционная решетка). Такая решетка, облучаемая параллельным пучком света, как известно, вызы-вает дифракцию света в определенных направлениях. Задача состоит в том, чтобы найти метод определения параметров дифракционной картины и интерпретировать ее так, чтобы извлечь как можно больше информации об объекте. С этой целью в микроскопе за исследуемым объектом размещают увеличительные линзы. Рис. 8 поясняет ход лучей при таком расположении линзы и объекта. Линза собирает в точку на фокальной плоскости, расположен-ной между линзой и экраном, все параллельные лучи, испускаемые различными точками объекта. Таким образом в этой плоскости возникает особое распреде-ление энергии, которое, согласно Аббе, называется первичным, изображением объекта. В рассматриваемом случае в фокальной плоскости, расположенной перпендикулярно плоскости рисунка, появлялось бы семейство параллельных линий, которое следует рассматривать как дифракционную картину.

За фокальной плоскостью лучи вновь расходятся. В другой плоскости, которая тоже показана на схеме, в точку сходятся те лучи, которые расходятся в разных направлениях из одного и того же места объекта. Лучи, которые сходятся в соответствующей точке изображения, испущены, как показано на рис. 8, из различных дифракционных точек первичного изображения и проходят поэтому различные пути. Поскольку эти лучи, когерентны, то они интерферируют между собой. Таким образом, в плоскости изображения возникает вторичное действительное изображение объекта как результат интерференции лучей, испущенных первичным изображением. Чем большее количество лучей дает вклад в изображение точки, т. е. чем больше число дифрагированных лучей попадает в объективную линзу, тем выше соответствие изображения самому объекту. Согласно правилу Луммера:

Если оптическая система формирует изображение без искажений и улавливает весь дифрагированный объектом свет, то изображение правильно передает распределение амплитуд и фаз излучения, рассеянного объектом.

Однако требование улавливания объективом всех дифрагированных лучей света практически невыполнимо. В то же время, по крайней мере, в случае сложного объекта, трудно предсказать, насколько сильно подействует на качество изображения использование части дифрагированного излучения.

Поэтому, большое преимущество электронной микроскопии перед свето-вой заключается в том, что изображение объекта при высоком увеличении и даже без учета вклада дифракционных максимумов высоких порядков доста-точно хорошо соответствует объекту.

Как в световом, так и в электронном микроскопе в фокальной плоскости объектива возникает дифракционная картина объекта, как показано на рис. 8. Однако происхождение дифракционных картин, на оптическом и на элект-ронном микроскопах принципиально различно.

На светооптическом изображении периодического объекта можно отчет-ливо определить элементы, вызвавшие дифракцию света,- то есть объект исследования, являясь прозрачным для световых волн, формирует изображение в котором можно отчетливо видеть внутреннюю структуру объекта. Напротив, на электронной микрофотографии кристаллов отсутствует изображение прост-ранственной решетки, вызвавшей дифракцию электронов. Даже при весьма высоком увеличении нельзя получить изображение кристаллической решетки *. Причина этого заключается в условиях формирования изображения. В фор-мировании светооптического изображения, участвуют все обнаруживаемые на первичном изображении дифракционные максимумы. В изображение вносят свой вклад дифракционные максимумы нулевого и первого порядков, как это видно из схемы, показанной на рис. 8. В этом случае изображение правильно передает количество узлов и расстояние между ними в исходной решетке.

На электронной микрофотографии изображение сформировано только центральным пучком (т. е. дифракционным максимумом нулевого порядка). Вследствие большой сферической аберрации электронных линз приосевой угол лучей, формирующих изображение, должен быть малым, что обеспечивается диафрагмой (так называемой апертурной диафрагмой). Поэтому для формирования изображений, вообще говоря, невозможно использовать все лучи, дифра-гированные на кристаллической решетке. Все дифракционные максимумы (рефлексы), за исключением центрального, задерживаются апертурной диаф-рагмой, поэтому изображение кристаллической решетки возникнуть не может.

Согласно правилу Луммера, одно из условий правильной передачи распре-деления амплитуд и фаз на изображении объекта состоит в том, что весь дифрагированный на объекте свет должен попасть в объектив. Однако для формирования изображений в электронном микроскопе обычно используются дифракционные максимумы только первого порядка, что естественно, приводит к потере информации. Причем повышение увеличения изображения также не привело бы к получению дополнительной информации.

Тот факт, что в электронном микроскопе даже один дифракционный максимум нулевого порядка (центральный пучок) формирует изображение, на первый, згляд противоречит требованию Аббе, согласно которому для форми-рования действительного изображения объекта (т. е. вторичного изображения) необходим по меньшей мере еще один дифракционный максимум. Однако следует помнить, что электронные лучи дифрагируют на кристаллической решетке, изображение которой в нормальных условиях не должно возникать. Должно возникнуть изображение лишь геометрической формы кристалла. Все дифракционные эффекты, обусловленные геометрической формой кристалла, благодаря малой длине волны электронов содержатся и в центральном пучке. Правда, поскольку апертура освещающего пучка электронов конечна, эти дифракционные эффекты  нельзя увидеть, однако их удается наблюдать с помощью некоторых приемов, для чего:

а) объекты должны быть как можно меньшего размера, чтобы отклонение луча при дифракции стало большим;

б) источник излучения и телесный угол (апертура) электронного луча должны быть как можно меньше, чтобы дифракционная картина стала максимально резкой.

При сравнении процессов формирования изображений в световом и элект-ронном микроскопах становится ясным, что в последнем дифракционная кар-тина (обычно она называется электронограммой), играет совершенно иную роль в формировании изображения, чем дифракционная картина в световой микроскопии. Все обнаруживаемые на дифракционной картине оптического микроскопа рефлексы дают вклад в формирование увеличенного изображения. Напротив, вся энергия, сконцентрированная в дифракционных максимумах более высокого, чем нулевой, порядка, потеряна при формировании изображе-ния в электронном микроскопе. Это принципиальное различие следует постоянно учитывать при расшифровке электронных микрофотографий. Этим объясняется также особое значение электроннограммы по сравнению с дифрак-ционной картиной, образованной в световом микроскопе.  Электронограмма  содержит значительно больше информации, чем электронная микрофотогра-фия. Она дает ключ к расшифровке кристаллической структуры, а электронная микрофотография - сведения о размерах и форме кристаллов*.

На рис. 8 в качестве объекта была выбрана абсорбционная решетка. Во многих других случаях объекты, исследуемые в оптическом микроскопе, также являются абсорбционными решетками, например одноцветные биологические или медицинские препараты. Объекты, которые можно рассматривать как фазо-вые решетки, часто окрашиванием в один цвет превращаются в абсорбцион-ные объекты. При исследовании чисто фазовых объектов методом фазового контраста контраст на вторичном изображении усиливается за счет воздействия на первичное изображение. При этом за счет сдвига фаз условия интерферен-ции между дифрагированными и первичными лучами можно изменить таким образом, чтобы на вторичном изображении различие в коэффициентах прелом-ления соседних областей объекта проявлялось в виде контраста. Многие электронномикроскопические препараты следует рассматривать как чисто фазовые объекты. При этом почти все электроны проникают сквозь препарат, и их поглощением можно пренебречь. Если бы в электронном микроскопе все линзы обладали почти одинаковой апертурой и их ошибки можно было исправлять, как это имеет место в световом микроскопе, то в принципе можно было бы повысить разрешающую способность, но одновременно следовало бы предпринять особые меры для усиления контраста изображения.

В современных электронных микроскопах с линзами, обладающими очень малой апертурой, такого рода меры не нужны, поскольку из утверждения, что для формирования реального изображения кристаллического объекта в обыч-ных случаях используют дифракционные максимумы нулевого порядка, не следует вывод, что дифракционные максимумы более высоких порядков не влияют на распределение контраста изображения. Во всех точках объекта, в которых в соответствии с законами физики возникает дифракция на простран-ственной решетке, из центрального пучка отводится и затем задерживается апертурной диафрагмой часть энергии. В соответствующих точках электронно-микроскопического изображения кристаллического объекта эта энергия должна отсутствовать и эти области будут темнее окружающих, так как часть электро-нов первичного пучка за счет дифракции отклоняется в других направлениях.

Контраст на изображении, возникающий в результате дифракции, называ-ется дифракционным контрастом. Этот механизм возникновения контраста действует не только в кристаллических объектах. В аморфных объектах часть рассеянного излучения также задерживается апертурной диафрагмой. Такой тип контраста называется абсорбционным. Принципиальное различие между этими двумя типами контраста отсутствует. Каждый является результатом упругого рассеяния электронов на атомных ядрах. Происхождение дифракци-онного контраста, который весьма важен для интерпретации электронных микрофотографий, полученных при проведении прикладных или теоретических исследований, невозможно понять без знания законов дифракции, которые удобнее рассматривать на примере теории дифракции ренгеновских лучей.

1.2.3. Основы теории дифракции. Дифракция рентгеновских лучей

Как уже отмечалось при формировании изображения в электронном микроскопе на первом этапе формируется дифракционная картина объекта. Иными словами в микроскопе из реального объекта в прямом пространстве формируется изображение в обратном или дифракционном пространстве. Полученная дифракционная картина в отличие от аналогичных изображений оптического микроскопа несет в себе значительную информацию об исследу-емом объекте. Дифракционные картины полученные с помощью электронного микроскопа даже более информативны, чем рентгеновские, так как несут в себе информацию о фазах рефлексов.

Кроме того для исследования электронных микрофотографий полученных в прямом пространстве традиционно используют методы их оптического диф-ракционного анализа предложенного еще в 1964 году лауреатом Нобелевской премии Клугом [Klug, Berger, 1964]. Здесь объектом дифракционного анализа являются электронные микрофотографии, то есть изображения объектов в прямом пространстве. Все дело в размере дифракционной решетки и длине волны падающего на нее излучения, которые для наблюдения дифракционной картины должны быть одного порядка.

Электромагнитная волновая природа рентгеновских лучей позволяет провести аналогию между возникновением изображения при дифракции рентгеновских лучей и образованием изображения лучами видимого счета. В оптическом микроскопе, как уже отмечалось выше, объект освещается пучком света и рассеивает его, а рассеянные лучи собираются линзами объектива и, рекомбинируясь, дают изображение объекта. В случае рентгеновских лучей первая часть процесса образования изображения та же. Кристалл освещается пучком рентгеновских лучей, а рассеянные лучи регистрируются на фотопленке. Однако для рентгеновских лучей аналогия с линзами объектива отсутствует. Вывод Рентгена о неспособности широкого круга веществ преломлять рентгеновские лучи остается более или менее правильным*. Это означает, что не существует материала, который можно использовать для фокусировки рентгеновских лучей. Однако теория дифракции позволяет аналитически рекомбинировать рассеянные лучи с помощью компьютера. Здесь есть только одна проблема: чтобы воссоздать изображение объекта по дифракционной картине, необходимо знать и фазу и интенсивность каждого дифрагированного луча. Однако в дифракционном эксперименте можно измерить только интен-сивности рассеянных лучей. Вся информация об их относительных фазах теряется. Определение этих фаз - основная проблема любого рентгенострук-турного исследования.

1.2.3.1. Закон Брэгга

Заслуга Брэгга состоит в представлении рассеяния рентгеновских лучей кристаллом как отражения от атомных плоскостей [Bragg, 1913], которые не обязательно должны быть параллельны граням кристалла.

На эти плоскости под углом скольжения J падают рентгеновские лучи, которые рассеиваются под тем же углом J (рис. 9). Падающий и дифрагирован-ный лучи находятся в одной плоскости с нормалью к дифрагирующим плоскостям. Интерференция лучей, рассеянных последовательными плоскос-тями кристалла, будет приводить к их усилению только в том случае, если разность хода лучей будет равна целому числу длин волн.

Пусть расстояние между последовательными атомными плоскостями равно d. Разность хода лучей 1 и 2 составляет АВ+ВС=2dsinJ. Следовательно, условие усиления при интерференции будет иметь вид

2dsinJ = nl.  (закон Брэгга),                            (1.2)

где l длина волны рентгеновских лучей (0,15418 нм для CuKa - излучения) и n - целое число.

Это фундаментальное уравнение предсказывает направление в простран-стве любого дифрагированного луча. Так, отражение первого порядка от дан-ной серии плоскостей будет происходить при угле J, который удовлетворяет закону Брэгга при п = 1; второго порядка - при п = 2 и т. д. Заметим, что, чем ближе друг к другу расположены плоскости (чем меньше d), тем больше угол дифракции J. Уравнение (1.2) не дает информации относительно интенсив-ности дифрагированного луча. Чтобы понять, как возникает различие интенсив-ностей дифрагированных лучей, используем аналогию с рассеянием света.

1.2.3.2. Аналогия с рассеянием света

Ранее мы рассмотрели кристалл как трехмерное периодическое расположе-ние элементарных ячеек, каждая из которых содержит одинаковое число моле-кул, расположенных таким образом, что каждая молекула находится в том же окружении, что и любая другая. В данных о дифракции рентгеновских лучей кристаллом заключена информация о строении молекулы, образующей незави-симую часть элементарной ячейки. Если известно строение независимой части элементарной ячейки, значит, известна структура всех остальных молекул кристалла. Пользуясь аналогией между рентгеновской дифракцией и дифрак-цией света, можно представить дифракционную картину, ожидаемую для одной молекулы, а также изменение этой картины при размещении молекул в кристаллической решетке. Хотя проблема определения кристаллической структуры - это трехмерная проблема, мы ограничимся двумерным случаем.

Схема прибора для получения оптической дифракционной картины показана на рис. 10. Лазерный источник создает интенсивный монохромати-ческий пучок. Свет выходит из малого круглого отверстия А, находящегося в передней фокальной плоскости собирающей линзы С. Молекула или кристалл имитируется рядом отверстий в непрозрачном экране. Этот объект, помещен-ный в плоскости М, освещается параллельным пучком света. Рассеянные лучи фокусируются дополнительной линзой S и дают изображение дифракционной картины в плоскости D. Дифракционная картина может быть сфотографиро-вана, если в этой плоскости поместить фотопленку, или же рассеянные лучи можно пропустить дальше, и с помощью системы линз объектива О получить изображение объекта в плоскости  I  [Klug, Berger, 1964].

В случае рентгеновских лучей, используя хорошо коллимированный пучок, можно зарегистрировать дифракционную картину кристалла на фото-пленке. Оптическое устройство аналогично случаю использования рентгенов-ских лучей вплоть до стадии плоскости дифракции D. Однако, из-за отсутствия линз, способных фокусировать рентгенрвские лучи, невозможно осуществить непосредственную рекомбинацию рассеянных рентгеновских лучей в противо-положность случаю дифракции видимого света.

Рассмотрим картину дифракции на очень простом объекте - круглом от-верстии в непрозрачном экране. Здесь, оптическая дифракционная картина (рис. 11) состоит из ряда светлых и темных колец, возникающих вследствие интерференции лучей света, прошедших через различные части отверстия. Чем меньше диаметр отверстия, тем больше диаметр первого темного кольца (это как раз один из многих примеров обратного соотношения размеров в реальном и дифракционном пространстве). При дифракции рентгеновских лучей размеры рассеивающего объекта (атомов) того же порядка, что и длина волны рентге-новских лучей.

1.2.3.3. Оптическая дифракционная картина молекулы

Теперь рассмотрим картину дифракции на некотором числе малых отвер-стий (или точек), расположение которых представляет молекулу. Шесть точек, расположенных по вершинам неправильного шестиугольника, порождают оп-тическую дифракционную картину, показанную на рис. 12, б. Поскольку раз-меры точек малы по сравнению с расстоянием между ними, в сущности наблю-дается малоугловая дифракционная картина в радиусе первого темного кольца дифракционной картины на отверстии. Интерференция лучей, рассеянных различными точками, приводит к непрерывному изменению интенсивности на дифракционной картине. Нерегулярное распределение интенсивности центро-симметрично относительно начала, что является общей особенностью всех дифракционных картин. Из этого примера можно заключить, что изменение интенсивности дифракционной картины обусловлено структурой молекулы.

Дифракционная картина, даваемая единичной молекулой, называется молекулярной трансформантой; или Фурье-трансформантой молекулы*.

Молекулярную трансформанту при дифракции света можно наблюдать потому, что свет относительно сильно взаимодействует с веществом. Рентге-новские лучи слабо взаимодействуют с веществом, и наблюдать трансфор-манты отдельных молекул невозможно. Поэтому соединение необходимо зак-ристаллизовать, чтобы все молекулы расположились регулярно, и рассеяние каждой молекулой усиливалось бы рассеянием всех других молекул. Рассмот-рим влияние на молекулярную трансформанту кристаллической решетки.

  1.2.3.4. Дифракционная картина решетки

Картина дифракции на ряде линий показана на рис. 13,а  и представляет ряд точек, перпендикулярный ряду линий, причем расстояние между точками обратно пропорционально расстоянию между линиями. Другими словами, трансформанта Фурье ряда линий - это ряд точек. Отметим, что справедливо и обратное: трансформанта Фурье ряда точек есть ряд линий. То есть мы встречаемся с проявлением обратной взаимосвязи между объектом в реальном пространстве и его дифракционной картиной.

Дифракционная картина другого ряда линий, расположенного иначе, чем первый, показана на рис. 13,б.   Наложением двух рядов линий можно получить решетку, как перемножение двух функций. Чтобы предсказать характер ожидаемой для такой решетки дифракционной картины, воспользуемся теорией преобразования Фурье.

Теорема: трансформанта Фурье свертки двух функций равна произведению их трансформант Фурье.

Обратная теорема: трансформанта Фурье произведения двух функций есть свертка трансформанты одной из них и трансформанты другой.


Свертка двух функций - это результат помещения начала второй функции в каждую из точек первой функции и умножения значения первой функции в этой точке на вторую функцию. 

Следовательно, если двумерную решетку рассматривать как произведение двух рядов линий, то дифракционная картина такой решетки есть свертка диф-ракционных картин обоих рядов линий. Дифракционная картина двух рядов ли-ний - два ряда точек. Свертка этих двух рядов точек есть решетка (рис. 13,в). Итак: дифракционная картина решетки есть также решетка, но с разме-рами, обратно пропорциональными размерам реальной решетки (рис. 13, а).

Расстояние между соседними точками дифракционной картины, или узлами обратной решетки, равно

             a* =                b* =               g = p - g*              (1.3)

где g - угол между рядами линий в реальной (прямой) решетке. Если каждый узел обратной решетки снабжен двумя целочисленными индексами h и k, то расстояние некоторого узла обратной решетки от начала дифракционной картины равно

d* = (h2а*2 + k2b*2 - 2hka*b* cos g)1/2

1.2.3.5. Дифракционная картина молекулы в решетке

Дифракционная картина молекулы, находящейся в двумерной решетке, может быть выведена из следующих соображений. Кристалл есть результат свертки молекулы и двумерной решетки - последовательное помещение моле-кулы в каждый из узлов решетки. Следовательно, дифракционная картина молекулярного кристалла есть произведение дифракционной картины моле-кулы (молекулярной трансформанты) на дифракционную картину решетки (обратную решетку). Произведение этих двух трансформант есть проявление молекулярной трансформанты в каждом узле обратной решетки. Пятно (рефлекс) на дифракционной картине (узел обратной решетки) будет иметь большую интенсивность, если соответствующая молекулярная трансформанта в этой точке имеет большую величину, рефлекс будет слабым, если вызвавшая его молекулярная трансформанта слаба (рис. 12, в-е).

Таким образом, видно, что "решеточная".эжхз-0 природа дифракционной картины обусловлена кристаллической решеткой, а интенсивность каждого рефлекса определяется значением молекулярной трансформанты в этой точке. В общем каждая часть молекулы вносит вклад в каждую часть дифракционной картины. И наоборот, чтобы реконструировать молекулу по ее дифракционной картине, необходимо измерить интенсивности всех рефлексов.

Когерентное рассеяние свободным электроном не завис.

ит от угла рассе-яния, если не учитывать множитель (1+cos22J), представляющий частичную поляризацию рассеянного луча. В атоме электроны занимают конечный объем и находятся в некоторых вполне определенных энергетических состояниях. Чтобы получить выражение для рассеяния атомом, необходимо учесть распре-деление электронов в пространстве.

Пусть электронная плотность на расстоянии r от центра атома равна r(r). Рассмотрим волну, рассеянную в точке r  в направлении  s, относительно волны, рассеянной одним электроном, находящимся в центре атома. Суммарная рассе-янная волна зависит от разности фаз между отдельными рассеянными волнами.


Пусть направление падающего излучения определяется вектором s0, а направление рассеянного излучения - вектором s. Для упрощения последующих выражений примем, чтоs0=s=1/l, где l -длина волны падающего излучения. 

 

Согласно рис. 14, разность хода лучей 1 и 2 составляет р - q, причем

p = lr s0   и   q = lr s

Разность фаз =  r (разность путей) = 2p r ( s0- s) = 2p r s, где s = s0- s

Вектор S используется для описания положения в дифракционном или обратном пространстве, так же как вектор r используется для описания положения в реальном или прямом пространстве.

Суммарная волна, рассеянная элементарным объемом dv в положении r, относительно волны, рассеянной в начале О, будет иметь амплитуду, пропорци-ональную r(r)dv, и фазу 2p r s, т. е. рассеянная волна = r(r)ехр(2p ir s)dv.

Таким образом, суммарную волну, рассеянную атомом, находят сумми-рованием индивидуальных вкладов по всему объему атома

F(S) = S)dv                            (1.4)

Это выражение представляет фактор атомного рассеяния. Распределение электронной плотности по всему объему атома точно известно (из квантовой механики) только для атома водорода. Обычно предполагается, что электронная плотность атома сферически симметрична. Тогда и фактор атомного рассеяния сферически симметричен, т. е. он не зависит от направления вектора S, а только от его абсолютной величины. Предположение о сферической симметрии r(r) включает и центросимметричность этой функции, т.е. r(r) = r(-r). Это означает, что при суммировании мнимые компоненты взаимно уничтожаются, и резуль-тат суммирования будет действительным, то есть функция f(S) действительна для всех S.

Заметим, что при S = 0

                      f(0) = dv = Z

где Z общее число электронов в атоме.

1.2.3.6. Рассеяние лучей молекулой и кристаллом

Теперь выведем уравнения рассеяния рентгеновских лучей совокупностью атомов, занимающих определенные положения в элементарной ячейке. Рассуж-дения справедливы и для рассеяния света совокупностью точек занимающих определенное место, но уже в элементарной ячейке микрофотографии (увели-ченного изображения объекта в прямом пространстве).

Рассмотрим атом  1 на рис. 15, который находится на расстоянии r1 от начала координат. Это смещение начала от центра атома означает замену величины r в уравнении рассеяния атомом на r + r1. Тогда рассеяние атомом 1 относительно нового начала координат будет

f1 = (r + r1)S)dv = f1exp(2pir1S)

где                 f1 = r S)dv


Аналогичное выражение можно записать для атомов  2, 3  и для всех дру-гих атомов элементарной ячейки. 

Суммарная волна, рассеянная всеми атомами, представляет векторную сумму индивидуальных вкладов всех атомов и описывается выражением

G(S) =  fj exp(2pirjS)                                 (1.5)

Это уравнение представляет молекулярную трансформанту. Это комплек-сная функция, которая изменяется по всему дифракционному пространству S.

Чтобы вывести выражение для рассеяния кристаллом, рассмотрим вначале случай одномерного кристалла, представляющего линейный ряд элементарных ячеек с периодом повторяемости а. Общая волна, рассеянная кристаллом, будет суммой волн, рассеянных каждой элементарной ячейкой.

Волна, рассеянная первой от начала ячейкой, будет просто G(S). Волна, рассеянная второй от начала ячейкой, будет G(S) x ехр(2piaS), так как все положения сдвигаются на вектор a. Следовательно, волна, рассеянная n-ой ячейкой, есть G(S) x ехр[2pI(n-1)aS], а для суммарной рассеянной волны имеем

F(s) =  ехр[2pi(n-1)aS],


где t общее число элементарных ячеек. 

Каким образом складываются эти индивидуальные вклады, показывает векторная диаграмма на рис. 16 а. Волна, рассеянная некоторой элементарной ячейкой, отличается по фазе от волны, рассеянной соседней ячейкой, на вели-чину 2paS. Следовательно, при увеличении числа элементарных ячеек суммарная рассеянная волна F(S) становится величиной того же порядка, что и молекулярная трансформанта G(S), которая, как мы уже знаем, в случае рентгеновских лучей слишком мала для наблюдения. Как же тогда наблюдается рассеяние кристаллом?

Рассеяние можно наблюдать только тогда, когда разность фаз между волнами, рассеянными последовательно расположенными элементарными ячейками, будет кратна 2p (рис. 16 б), т. е.

2pa S = 2ph           или            a S = h

где h целое число.

При этом условии волны складываются, давая рассеянную волну существен-ной интенсивности; эта волна имеет амплитуду, пропорциональную Тr|G(S)|. Для кристалла длиной 1 мм с параметрами элементарной ячейки порядка 10 нм имеем Т=105, то есть налицо значительный коэффициент усиления.

При переходе к трехмерному случаю с элементарной ячейкой, описыва-емой векторами   а, b  и  с,  условие дифракции приобретает вид

a S = h,

b S = k,

c S = l,

где h, k и l целые числа. Эти уравнения носят название уравнений Лауэ и представляют собой математическое выражение высказанного ранее положе-ния, что картина дифракции на решетке также представляет собой решетку.

Эти уравнения позволяют переписать выражение для суммарной волны, рассеянной кристаллом в направлении S, следующим образом:

F (S) =  fj exp(2pirjS)

где мы пренебрегли коэффициентом пропорциональности Т. Пусть xj, yj, zj - относительные координаты   j -го атома, т. е.

rj = axj + byj + czj.

Тогда из уравнений Лауэ

F (hkl) =   fj exp 2pi(hxj + kyj + lzj)                            (1.6)

причем в левой части уравнения величина    заменена на hkl.

уравнение (1.6) известно как уравнение структурного фактора. Оно представляет значение молекулярной трансформанты в узлах hkl обратной решетки. Если известны положения всех атомов в элементарной ячейке, то можно рассчитать соответствующую дифракционную картину.

1.2.3.7. Взаимодействие между условиями дифракции Лауэ и законом Брегга. Обратная решетка

Из определения   S = s - s0  видно, что если  s  характеризует дифрагиро-ванный луч, то в соответствии с законом Брэгга он должен рассеиваться под углом 2q, причем значение q определяется уравнением

2d sin q = nl.

Поскольку

 s = s0 =,

то              S =  =             (при  n = 1)

Модуль вектора S, определяющего некоторую точку в дифракционном пространстве, обратно пропорционален расстоянию между плоскостями, создающими данный дифракционный пик.

Мы уже отмечали, что картина дифракции на решетке также представляет собой решетку, размеры которой обратно пропорциональны размерам реальной (прямой) решетки. Охарактеризуем дифракционную решетку (обратную решетку) векторами а*, b* и с*. Дифракционный вектор S определяется расстоянием от начала до данного узла обратной решетки, т. е.

S = hа* + kb* + lс* .

Теперь найдем взаимосвязь между векторами прямой и обратной решеток.

Из уравнений Лауэ          a S = h,        b S = k,          c S = l.

Отсюда

a a*   = 1,

a b* = 0,

a c* = 0

b a*  = 0,

b b*  = 1,

b c* = 0

c a*  = 0,

c b*  = 0,

c c* = 1

Из этих уравнений следует, что а* и b* перпендикулярны оси  с  прямой решетки. И наоборот ось с* перпендикулярна а и b.

Итак рассеяние рентгеновских лучей атомом, или элементом изображения молекулы на микрофотографии описывается фактором атомного рассеяния. Рассеяние рентгеновских лучей молекулой, или группой элементов изображе-ния описывается молекулярной трансформантой. Дифракция молекулой, находящейся в кристаллической решетке, определяется уравнением структур-ного фактора, которое дает значения молекулярной трансформанты в узлах обратной решетки, определяемые условиями, накладываемыми на S, в виде уравнений Лауэ. Таким образом, зная структуру кристалла, всегда можно рассчитать его дифракционную картину. Дифракционная картина представляет трансформанту Фурье структуры. И наоборот, структуру кристалла, которая описывается электронной плотностью r (x,y,z) в каждой точке элементарной ячейки, можно рассчитать как трансформанту Фурье дифракционной картины.

1.2.4. Анализ изображений на электронных микрофотографиях

Наиболее эффективными методами исследования пространственного расположения субъединиц являются электронная микроскопия и рентгенеструк-турный анализ. Преимуществом электронной микроскопии является сравни-тельная быстрота исследования и возможность работы с одиночными части-цами. Модели, которые она дает, способны охарактеризовать симметрию в расположении субъединиц и дать представление об их форме. Электронная микроскопия также может выявить доменную структуру и охарактеризовать количество и возможную симметрию в расположении доменов.

Возможности электронной микроскопии при исследовании биополимеров ограничены двумя факторами:

I) Необходимостью контрастирования молекул, в результате чего разреше-ние структуры во многом определяется способностью контрастера выявить тонкие детали структуры и сохранить их без искажения. До настоящего времени для усиления контраста изображения и одновременно предохранения структуры при высыхании широко используется негативное контрастирование [Horn & Brenner, 1958]. Изображение молекул на микрофотографиях в этом случае рассматривается как картина распределения контрастера вокруг исследуемой частицы (рио.17). Важной особенностью негативного контрастирования явля-ется то, что изображение молекулы или ассоциата молекул представляет собой двумерную проекцию всей ее структуры. Это, как будет показано дальше, открывает возможность для интерпретации внутренней структуры частиц, а в оптимальном варианте - для трехмерной реконструкции. В качестве негатив-ного контрастера обычно используют молибдат аммония, фосфорновольфра-мовую кислоту, вольфрамат натрия, уранилацетат. Весь опыт исследований говорит о том, что уранилацетат обеспечивает наилучшее разрешение, но некоторые молекулы не выдерживают взаимодействия с ним. В этом случае используют другие констастеры, например, молибдат аммония. Известно несколько белков, для которых использовать негативное контрастирование оказалось невозможным. В этих случаях единственно возможным методом контрастирования является оттенение, когда выявляется только поверхностный рельеф частиц с разрешением  2,5 - 3,0 нм.

2) Разрушением объекта под действием электронов. Те же самые электроны, ко-торые создают изображение, приводят к радиационным повреждениям объекта. В настоящее время обычно разрешение структуры молекул лимитируется не разрешащей способностью приборов, которая сейчас составляет около 0,2нм, а тем пределом, до которого структура разрушена пучком. При использовании не-гативного контрастирования и обычных доз облучения (2-3 эл/нм2) разрешение составляет около 2,0 нм. При средних дозах (0,2-0,5 эл/нм2) достигают 1,0 нм.

  

 

 

 

 

 

 


 

Не следует думать, однако, что достигнут предел возможностей электрон-ной микроскопии. Все время ведутся интенсивные разработки новых методов, позволяющих увеличить разрешение биологических объектов. Например, чтобы предохранить родопсиновые мембраны (или тонкие белковые кристаллы) от разрушения при высыхании, воду в них замещают глюкозой [Unwin & Hender-son, 1975]. Используя съемку родопсиновых мембран с дозами 0,005 эл/нм2, получили сильно недоэкспонированные "статистически зашумленные" изобра-жения. Денситометрирование больших площадей этих изображений и усредне-ние по сотням ячеек кристаллической решетки, позволило получить расчетные изображения с разрешением 0,6 нм и увидеть a- спирали в молекуле бактерио-родопсина. Это же разрешение на этом же объекте, но уже с большими допусти-мыми дозами, было достигнуто при съемке замороженных образцов [Hayward & Glaeser , 1979]. Методами криогенной электронной микроскопии в последнее время получены хорошие результаты и для тонких нитей скелетной мышцы [Orlova et al., 1995].

B подавляющем большинстве случаев электронная микроскопия биологи-ческих макромолекул не ограничивается получением микрофотографий. Любой электронный микроскопист фактически всегда производит визуальную обра-ботку изображений молекул или их ассоциатов пытаясь дать в той или иной степени обоснованную интуитивную оценку их структуры. При специальной визуальной обработке, изображения частицы классифицируют и приписывают тем или иным проекциям. Определенный вклад на этом этапе может дать использование съемки с наклоном в электронном микроскопе с применением гониометрической головки. Изучаемые частицы моделируют. Методом "проб и ошибок" в ряде случаев удавалось получить достаточно точные модели. Чтобы приблизить изображения моделей к условиям негативного контрастирования, иногда используют метод Каспара [Caspar, 1966], когда модель окружают веществом (гипс, пластилин) более плотным, чем вещество модели и затем делают рентгеновский снимок. Изображения моделей можно строить с помощью ЭВМ, соединенной с дисплеем.

Электронная микрофотография регулярно построенного объекта, напри-мер кристалла белка, содержит много изображений некоторого повторяюще-гося элемента. Если образец истинно регулярен, эти элементы должны быть одинаковыми, хотя на электронной микрофотографии их изображения могут различаться из-за шумов, связанных с нарушениями структуры, неоднород-ности окрашивания, зернистости пленки-подложки и т. д. Естественно, что специалисты в области электронной микроскопии, должны были разработать метод, который допускал бы точный анализ таких периодических образцов и устранял влияние шумов.

Наиболее прямой подход к решению этой проблемы дает оптический дифрактометр [Klug, Berger, 1964]. Схематический вид этого прибора приведен (рис. 10). Монохроматизированный лазерный пучок выходит из малой апер-туры, которая находится в передней фокальной плоскости конденсорной линзы С. Электронную микрофотографию помещают в положение М и освещают параллельным пучком света. Изменения оптической плотности на электронной микрофотографии приводят к рассеянию света, и рассеянные лучи собираются линзой S, давая изображение дифракционной картины в плоскости D. Можно или регистрировать эту дифракционную картину на фотопленке, находящейся в положении D, или же позволить дифрагированным лучам проходить дальше и фокусироваться системой линз О с образованием изображения электронной микрофотографии в плоскости изображения I.

Первая стадия этого процесса (образование дифракционной картины) относительно проста и может быть выполнена с линзами среднего качества. Дифракционная картина весьма информативна. Часто выявляются периодич-ности, которые трудно обнаружить визуально на исходных микрофотографиях. Поскольку все регулярно повторяющиеся элементы, содержащиеся в освещаемой области, дают вклад в дифракционную картину, из нее можно получить более точные сведения о периодах идентичности, параметрах элементарной ячейки и ее симметрии, чем из микрофотографии, при условии, что оптический дифрактометр точно настроен. Объективную оценку разрешения микрофотог-рафии получают, измеряя максимальные наблюдаемые на дифракционной картине межплоскостные расстояния. Наконец, дрейф образца и астигматизм линзы объектива порождают характерные особенности изображения, которые проще всего обнаружить на дифракционной картине зернистой углеродной пленки-подложки.

Следующая стадия - оптическая фильтрация шума и реконструкция филь-трованного изображения - требует очень тщательной юстировки оптического дифрактометра и очень высокого качества линз. Чтобы понять сущность процесса фильтрации, отметим, что регулярные части электронной микрофото-графии дают на дифракционной картине вклад в дифракционную решетку, тогда как нерегулярные флуктуации, обусловленные шумом, дают вклад в общее фоновое рассеяние. Поэтому, если в плоскости дифракционной картины поместить экран с отверстиями, соответствующими узлам дифракционной решетки, то дифрагированные лучи, обусловленные шумами, не смогут достичь плоскости изображения. Экран должен быть изготовлен тщательно и точно соответствовать наблюдаемой решетке. Те дифрагированные лучи, которые могут пройти сквозь экран, собираются системой линз О, образуя отфильтро-ванное изображение. На рис.18 проиллюстрированы стадии этого процесса. Оптически отфильтрованное изображение по-прежнему содержит многие
особенности исходной микрофотографии, но периодический характер решетки и форма отдельных субъединиц белка выявлены значительно отчетливее.

Оптическая фильтрация и реконструкция изображения легко осуществи-мы, но они страдают тем недостатком, что из-за несовершенства линз могут возникнуть артефакты. Эта проблема особенно серьезна для системы линз О, которая должна собирать широко расходящиеся лучи увеличенной дифракци-онной картины. Эту проблему можно решить, используя ЭВМ для расчета преобразования Фурье [DeRosier, Klug, 1968]. Выбранную область электронной микрофотографии сначала переводят в цифровое выражение с помощью авто-матического денситометра. Затем рассчитывают трансформанту Фурье, жела-тельно посредством процедуры быстрого фурье-преобразования [Cooley, Tukey, 1965], что дает численные значения амплитуд структурных факторов дифрак-ционной картины и их фаз. На реконструированном с помощью компьютера изображении различные уровни плотности представляют изолиниями. Иногда используется смешанный синтез, когда фазы берут из изображений, а ампли-туды из картин электронной дифракции или рентгеновских дифракционных картин [Аmos & Baker, 1979]. Фильтрация от фона заключается в избиратель-ном устранении шума и реконструкции изображение обратным преобразова-нием Фурье. Отметим, что при этих расчетах не возникает фазовой пробле-мы, поскольку структура уже содержится в электронной микрофотографии.

Маркхем [Markham et al., 1963] описал простой метод для обработки изображений имеющих симметрию вращения. Использующееся для этой цели приспособление состоит из вращающегося диска с делениями (столика), на котором помещается фотобумага. Края диска имеют угловые деления. Изображение исследуемой частицы с помощью фотоувеличителя проектируется на фотобумагу, находящуюся на диске. При этом предполагаемая ось симмет-рии вращения частицы совмещается с осью диска возможно точней. Затем на фотобумагу делается N- я часть необходимой экспозиции (где N - предполагаемый порядок оси вращения). Далее диск поворачивается на угол 360/ N  и делается повторная экспозиция. Это все повторяется N раз. Максимальное усиление деталей и вместе с тем сходство с первоначальным изображением получается когда N - истинный порядок оси вращения.

Метод реконструкции изображения был распространен на трехмерный случай для воссоздания изображений частиц [DeRosier, Klug, 1968, DeRosier, Moore, 1970]. Этот метод основан на теореме проектирования, которая утверж-дает, что двумерная трансформанта Фурье плоской проекции трехмерного распределения плотности идентична соответствующему центральному сечению трехмерной трансформанты, нормальному направлению проектирования. Поэтому трехмерную трансформанту Фурье можно строить сечение за сече-нием, используя преобразования для различных направлений проектирования объекта, а трехмерная реконструкция изображения получается обратным преобразованием Фурье. Эта методика была с успехом применена к структуре регулярного сферического вируса [Crowther , 1971], а также для декорирован-ных спиральных волокон актина [Moore, 1970]. В обоих случаях, благодаря симметричности объекта, для получения необходимого изображения оказалось достаточно одной микрофотографии. Для других объектов необходимо, наклоняя образец, получить несколько микрофотографий при различных ориентациях образца. Этот метод был использован Хоппе и сотр. [Hoppe et al., 1974] для трехмерной реконструкции индивидуальных негативно окрашенных молекул синтетазы жирной кислоты дрожжей.

Ранее было отмечено, что контрастность может быть создана за счет эффектов и амплитудного, и фазового контраста, которые обусловлены расфо-кусировкой и сферической аберрацией линзы объектива. Фазовый контраст оказывается преобладающим при среднем и высоком разрешениях. Эффекты фазового контраста проявляются значительно проще в фурье-преобразбвании изображения, чем в самом изображении, и поэтому эти эффекты можно легко анализировать с помощью оптического дифрактометра или трансформант, полученных на ЭВМ. В волновой теории формирования изображения эффекты сферической аберрации и расфокусировки приписываются фазовому сдвигу c(a), испытываемому волной рассеянного электрона в дифракционной плоскости микроскопа. Этот сдвиг зависит от угла рассеяния а и равен

c(a) =

где СS - коэффициент сферической аберрации и Df - расфокусировка (положи-тельна при недофокусировке). Трансформанта фазовоконтрастного изображе-ния Tph, связана с истинной трансформантой объекта Т(a,j) соотношением

Tph = - Т(a,j) A(a) f(a) sinc(a)                          (1.7)

где a, как и ранее, угол рассеяния, j - азимутальная координата, f(a) - атом-ный фактор рассеяния для электронов, а A(a) - функция апертуры объектива [A(a)=1, если a угла, определяющего апертуру; в остальных случаях A(a)=0]. Вышеприведенное выражение показывает, что истинная трансформанта моду-лируется тремя множителями, наиболее важный из которых sinc(a) известен как функция переноса [Hanzen, 1971]. Эта функция оказывает следующее воздействие на члены, отвечающие пространственному разрешению l/a:

1)     если значение sinc(a) близко к 1, то эти члены дают вклад в трансформанту Фурье со своим полным весом, и детали, отвечающие этому разрешению, будут правильно переданы в изображении;

2)     если значение sinc(a) близко к нулю, то члены с соответствующим пространственным разрешением будут исключены из трансформанты и не внесут вклад в конечное изображение;

3)     если sinc(a) меняет знак, то члены, соответствующие этому разрешению, будут давать вклад в окончательное изображение с обратным контрастом, что порождает опасность ложных изображений. Поэтому необходимо выполнение требования, чтобы член sinc(a) был относительно инвариант-ным во всем представляющем интерес интервале разрешений.

 

Эриксон и Клуг [Erickson, Klug, 1971] рассчитали кривые sinc(a) для различных степеней недофокусировки. Полученные результаты представлены на рис. 19, который показывает, что недофокусировка величиной 90 нм пред-почтительна для изображения деталей при разрешениях между 2,0 и 0,5 нм, тогда как для деталей в интервале от 5,0 до 2,0 нм оптимальна большая степень недофокусировки (500 нм). То обстоятельство, что sinc(a) стремится к нулю, когда a стремится к нулю, не существенно, поскольку при низком разрешении детали будут правильно воспроизведены за счет амплитудного контраста. В той же работе было исследовано влияние функции переноса на реальное изображе-ние. Была получена серия электронных микрофотографий кристаллов каталазы, негативно контрастированных уранилацетатом, при различных степенях недо-фокусировки. Три из этих микрофотографий вместе с соответствующими кар-тинами оптической дифракции показаны на рис. 20. При Df =0 фазовый конт-раст равен нулю для эффективного интервала разрешений, в пределах которого образец сохраняется, так что контрастность изображения обусловлена исклю-чительно амплитудным контрастом. Видно, что члены высокого разрешения на оптической дифракционной картине слабы или отсутствуют. При Df = 540 нм многие  члены  высокого   разрешения  усилены,   и  микрофотография содер-жит больше деталей и отличается лучшей контрастностью.  При  Df = 1450 нм (т.е. 1,45 мкм) становится заметным влияние быстро осциллирующей функции переноса в условиях сильной недофокусировки. Поскольку эти колебания про-исходят в пределах пространственной частоты трансформанты Фурье каталазы, возникают значительные искажения изображения. Таким образом, это подроб-ное  исследование способствовало более глубокому пониманию одной  из наи-более важных особенностей формирования изображения. Эриксон и Клуг делают такое заключение: Умеренно недофокусированные микрофотографии, используемые в большинстве работ по биологической микроскопии, представ-ляют правильные изображения, часто самые лучшие по разрешению и конт-растности, без артефактов в представляющей интерес области низкого и среднего разрешения [Erickson, Klug, 1971].

В той же работе Эриксон и Клуг [Erickson, Klug, 1971] исследовали также степень многократного рассеяния (эффект Реннингера) в тонком кристалле бел-ка. Хотя имелись некоторые признаки искажения интенсивности одного из от-ражений, для очень тонких образцов такие эффекты, по-видимому, будут малы.

В большинстве случаев изображение макромолекул является двумерной проекцией всей ее структуры. Если есть несколько таких проекций, трехмерная структура может быть восстановлена или с помощью визуального построения, или тем или иным методом трехмерной реконструкции. Наиболее распростра-ненными являются методы двойных преобразований Фурье, где операция совмещения проекций осуществляется в обратном пространстве [DeRosier & Klug, 1968] и метод модифицированных проектирующих функций академика Б.К. Вайнштейна ( 1968, 1971, 1973). где проекции совмещаются в резальном пространстве. Метод трехмерной реконструкции подробно рассмотрен в следующей главе. Электронную микроскопию в сочетании с трехмерной реконструкцией иногда называют "трехмерной электронной микроскопией".

Следует отметить, что структура белков не является самым благоприятным объектом для электронной микроскопии. Однако, многие связанные с этими исследованиями методические разработки,  позволяют  изучить  и  такие  важные для молекулярной биологии структуры как нуклеосомы, рибосомы и некоторые другие, где возможности рентгеноструктурного анализа существенно меньше. Что касается структуры белков, то в последнее время становится все более очевидным, что наиболее важные ее функциональные аспекты выявляются только при самом высоком разрешении. Поэтому для определения статичных структур (без учета динамической структуры) значение рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением (0,2-0,3 нм) становится определяющим.

1.2.12. Трехмерная реконструкция.     

Если мы имеем трехмерный объект, то он описывается некоторой функцией r(x,y,z) заданной в ограниченной области (см. рис.21). Проекция r(r) вдоль некоторого направления  y  на перпендикулярную к  у  плоскость  xz  можно представить следующим образом.

L(x,z)=                                (1.8)


  

Функция L(x,z) является интегральным представлением функции r(r). Если непрерывно менять направление проектирования у, то получается некий непре-рывный набор L(x,z) причем r(r) будет однозначно определять совокупность L(x,z). Отсюда очевидно и обратное, совокупность L(x,z)  определяет исходную функцию r(r), то есть совокупность проекций определяет форму исходной структуры. Можно свести трехмерную задачу к двухмерной, если все проектирующие направления yj, компланарны - допустим все перпендикулярны к z. Такие проекции можно назвать коаксиальными. В таких проекциях двумер-ные сечения трехмерной функции r(r) будут проектироваться в одномерные функции Lj(xi,zk)

В этом случае, если yj ( направление проектирования) будет зависеть от j (угла под которым происходит проектирование), то для каждого уровня zk

L(j,xj) = j                                    (1.9)

то есть мы имеем для какого уровня zk набор одномерных проекций. Имея набор одномерных проекций для какого-то значения zk можно постоитъ двумерные сечения rz(r) по которым можно восстановить трехмерное распределение плотности r(r).

Как уже отмечалось многие биологические молекулы и их ассоциаты симметричны. Если объект обладает осью симметрии порядка  N, то

L(j,xj) = L(j +i(2p/N),xj +i(2p/N))                          (1.10)

i = 1, 2, 3,, N

Таким образом из (1.10) можно заключить, что одна проекция симметричного объекта (р) эквивалентна N (для N нечетных), или р = N/2 (для N четных) проекциям ассиметричного объекта.

Если же объект обладает спиральной симметрией, то-есть содержит винто-вую ось симметрии Sр/q, то при проектировании перпендикулярно этой оси, будет выполняться условие:

L(j, xj, z) = L(j +i(2pq/p), xj +i(2p/N), z+ i(c/p))                     (1.11)

i = 1, 2, 3,, p

Так как при повороте на угол j=2pq/p, объект переходит в эквивалентное положение при сдвиге вдоль оси Z на величину с/р.

Для спиральных структур с группой симметрии Sр/qN порядок группы  n=pN, и одна проекция эквивалентна  n   или  n/2 (для четных N) проекциям.

Существует несколько методов трехмерной реконструкции:

1) Алгебраический метод, который предложен и применен для расшиф-ровки некоторых структур [Вайнштейн Б.К., 1968, 1970, Вайнштейн Б.К. и др.1968, Vainshtein et al., 1969, БарынинВ.В., Вайнштейн Б.К., 1971]. Этот метод также применялся и другими авторами [Crowther et al., 1970].

2) Метод двойного преобразования Фурье, который был предложен для трехмерного восстановления в электронной микроскопии ДеРози и Клугом  [DeRosier & Klug, 1968, Crowther et al., 1970, DeRosier & Moore, 1970]. Транс-форманта Фурье функции r(r) и ее проекции L(х) связаны между собой:

= F[r] = F(S)                        (1.12)

здесь S(X,Y,Z) вектор обратного пространства. С другой стороны

= F[L] = F(X,0,Z)                    (1.13)

Трансформанта Фурье функции L(x) является сечением обратного пространства. Итак схема реконструкции при двойном преобразовании Фурье имеет вид:

набор Li набор F[Li] F(S) r(r)                      (1.14)

Таким образом по набору проекций делается преобразование Фурье и получа-ется набор трансформант Фурье для этих проекций. Далее проводится интерпо-ляция между ними и получается некоторая функция в обратном пространстве F(S), обратное преобразование Фурье которой дает трехмерное распределение плотности в прямом пространстве r(r).

3) Метод синтеза проектирующих функций был предложен и применен Б.К.Вайнштейном (1970, 1971). Этот метод не требует проведения преобразова-ния Фурье. Одномерная проекция Li(xi) по направлению yi , линейно "размазыва-ется" вдоль направления проектирования yi. При этом получается двумерная проектирующая функция:               Li(xiyi) = L(xi)1(yi)

Накладывая на плоскость   хy   р   функций  Li(xiyi) получаемфигуру, описыва-емую функцией:

                                  (1.15)

При непрерывном распределении проекций

                      (1.16)

где r - двумерный вектор, то есть Sp(r) является сверткой с r -1  и хорошо воспроизводит функцию r(r). Однако вокруг каждой точки r возникает фон, спадающий по закону   r -1:           r(r) =S(r) + фон

что является существенным недостатком метода.

4) Наглядным способом демонстрации метода синтеза проектирующих функций является их фотосуммирование. Метод фотосуммирования проекти-рующих функций заключается в следующем. Прежде всего выделяют одномер-ные функции распределения плотности из двумерной проекции трехмерной структуры. Для этого объект разделяют вдоль оси  z, этим задача сводится из трехмерной в двумерную. Проектирующие функции получаются на специаль-ном приспособлении, которое размазывает одномерные сечения в двумерные. Все проектируюлне функции одного "сечения" суммируют на одну фотоплас-тинку под соответствующими углами и таким образом получается как бы двумерное сечение трехмерного объекта - синтез всех проектирующих функ-ций. Также можно получить и остальные сечения. Из полученных сечений, можно построить трехмерное изображение искомого объекта.

Метод фотосуммнрования проектирующих функций очень прост в своем исполнении и дает хорошие результаты в применении к исследованию структур белков из раствора. В этом случае число проекций ограничено точечной группой симметрии самой молекулы. Так описанным методом была исследо-вана структура белков: рибулозодифосфаткарбоксилазы [Самсонидзе Т.Г. и др., 1978] и лейцинаминопептидазы [Цупрун В.Л. и др., 1978].

Однако, как уже отмечалось, метод проектирующих функций обладает тем недостатком, что в процессе реконструкции структуры объекта по формуле (1.16), происходит возникновение фона.

5) Точное восстановление структуры в реальном пространстве основано на использовании метода модифицированных проектирующих функций, которую можно определить из обычной проектирующей функции [Вайнштейн Б.К., 1973; Вайнштейн Б.К., Орлов С.С., 1972; Ramachandran & Lakshminarayar, 1971] как

(xj) = L(xj) K(xj - xj) dxj                             (1.17)

где                                    K(x) =

некая функция одинаковая для всех углов. Здесь R=S модуль вектора обратного пространства. Далее для определения r(r) поступаем следующим образом

      r(r) = (Y,r) dY                                  (1.18а)

В случае конечного числа проекций

r(r) = i(Yi,r) dY                              (1.18б)

При этом (xY) нужно растянуть вдоль  y   для превращения их в (Y,r). Таким образом формулы (1.17, 1.18) дают путем оперирования в реальном простран-стве аналогично методу синтеза проектирующих функций теперь уже точное восстановление r(r). Для этого нужно предварительно получить модифициро-ванную проекцию (1.17) [Вайнштейн Б.К., 1973. Вайнштейн Б.К., Орлов С.С., 1972].

(xY) = -          (1.19)

И далее r(r) восстанавливается по (1.18). Здесь в отличие от (1.17) не требуется перехода в обратное пространство и осуществляется непосредственный переход:

 


 

При использовании модифицированных проектирующих функций  (xY) приобретает минимумы, которые "срезают" положительный фон, возникающий при интегрировании по углам Y от других   (xY),   то есть вместо             мы имеем "обостренную" функцию (xY). Практически интегрирование по углам заменяется суммированием (1.18б) конечного числа модифицированных проектирутацих функций   i (xY). Итак, использование методики модифици-рованных проектирующих функций дает точные результаты для реконструи-рованного r(r) вследствии срезания фона, который как мы уже отмечали, возникает при синтезе проектирующий функций.

К настоящему времени с применением различных методов трехмерной реконструкции изучено большое количество белков и их ассоциатов. Так, например, методом линейных уравнений (алгебраический метод) была исследована каталаза (мол. вес 240 000) [Барынин В.В., Вайнштейн Б.К., 1971]. Многие структуры были исследованы методом двойного преобразования Фурье. Так была исследована структура мышечного белка Ф-актина [Moore et al., I970], капсулы сферических вирусов животных и растений [Crowther et al., I970; Crowther, 1971], симметрично упакованные рибосомальные частицы и другие объекты. Рибоcомальные частицы в так называемых хроматоидных телах некоторых амеб укладываются в спиральные "жгутики", образующие паракриc-таллическую упаковку. Была проведена трехмерная реконструкция с разреше-нием 0,5 нм. В трехмерной модели хроматоидного жгута частицы укладки имеют форму, близкую к форме рибосом, исследовавшимся другими методами [Lake, 1972; Lake & Slater, 1972].

Метод двойного преобразования Фурье был использован и для изучения двумерных объектов - родопсиновых мембран [Unwin & Henderson, I975] и плоских слоев из молекул тубулина образованных в присутствии цинка [Аmos & Baker, I979]. Для получения необходимого набора проекций проводили съемку образца с наклоном в электронном микроскопе с использованием гониометрической приставки. Число проекций составляло несколько десятков, угол поворота достигал 57.

Методом синтеза проектирующих функций была изучена структура хвостовых отростков Т-четных фагов E.coli B-T2, Т6, DD6 [Михайлов А.М. и Вайнштейн Б.К., 1972]. Методы реконструкции дали сведения о трехмерной структуре многих хвостовых отростков, о форме и взаимном расположении образующих их белковых молекул.

С помощью метода модифицированных проектирующих функций были проведены еще ряд исследований спиральных структур, таких как трубчатые кристаллы глюкозооксидазы [Вайнштейн Б.К. и др., 1973], цитоплазматических  и жгутиковых микротрубочек [Цупрун и др., 1976; Самсонидзе Т.Г. и др., 1976].

1.3.  СТРОЕHИЕ КАРДИОМИОЦИТА

Миокаpд состоит из специализированных попеpечно-полосатых функци-онально активных единиц,  мышечных клеток - каpдиомиоцитов. Толщина клетки pавна 15-20,  а длина - 30-60 мкм  (pис 22). Клетка сеpдечной мышцы огpаничена оболочкой, саpколеммой, котоpая по концам  пеpеходит во вставочные диски. С помощью вставочных дисков клетки соединяются по длине между собой. Вставочные диски (гpаницы между клетками), как пpавило, pасположены на уpовне Z-линий миофибpилл (рис 22). Саpколемма имеет впячивания, называемые Т-тубулы (тpансвеpзальные каналы). Саpкоплазма мышечных клеток пpедставляет собой коллоидную сpеду. Она pаспpеделена неpавномеpно - ее много на пеpифеpии клетки и мало между миофибpиллами.

 Ядpо каpдиомиоцита, кроме как в периоде деления, имеет плотную кон-систенцию и почти pавномеpно заполнено ДHК, а ядеpное вещество получило название хpоматина. Во вpемя деления клетки хpоматин оpганизуется в хpомосомы, содеpжащие помимо ДHК (15%), РHК (10%) и белки (75%). Кле-точное ядpо содеpжит одно или несколько ядpышек - областей, чpезвычайно богатых РHК. Ядpышки - это места синтеза и вpеменного накопления pибосом-ной РHК, котоpая в больших количествах идет на сбоpку pибосом.

 Ядеpная оболочка, состоящая из двух мембpан, окpужает ядpо и отделяет его от пеpинуклеаpного пpостpанства. В мембpанах имеются поpы диаметpом 40-100 нм, по котоpым из ядpа в цитоплазму пpоходят РHК и дpугие вещества.

 К вставочным дискам пpикpепляются миофибpиллы каpдиомиоцита. Мышечные волокна миокаpда млекопитающих содеpжат около 100 миофиб-pилл. Миофибpиллы обpазуют цилиндpы диаметpом от 1 до 3 мкм и  pазделены темными мембpанами (Z-мембpанами) на элементаpные сокpатительные единицы саpкомеpы. Z-мембpаны беpут свое начало от саpколеммы. Толщина Z-мембpан 1,0 мкм.

Каждый саpкомеp состоит из толстых и тонких миофиламентов. Hа попе-pечном сpезе толстые миофиламенты pасположены гексагонально - каждая толстая нить окpужена 6 тонкими нитями, отстоящими дpуг от дpуга на 45 нм. Между собой в активном состоянии тонкие и толстые нити связаны попеpеч-ными мостиками. В центpе каждого саpкомеpа pасположен анизотpопный диск (А-диск, А-полоса) диаметpом около 12 нм и длиной 1,6 мкм. Он обpазован толстыми нитями. С обеих стоpон А-полосы pасположены изотpопные диски, содеpжащие тонкие нити (диаметpом 5 нм и длиной 1 мкм). Медиальные концы тонких нитей пpоникают в пpостpанство между толстыми и создают в А-диске области пеpекpытия толстых нитей с тонкими - H-зону. Латеpальные же концы пpикpеплены к Z-мембpанам.

Длина саpкомеpа в покое pавна 2,2 мкм. Во вpемя систолы она уменьша-ется до 1,85 - 1,9 мкм, а пpи максимальном сокpащении до 1,57 мкм [Sonnen-blick E.H., et al., 1964, Alpert et al., 1979].

 Митохондpии  (Мх) - "энеpгетические установки" клетки. Мх занимают более 30% общего внутpиклеточного объема сеpдечной мышцы [Page et al., 1971]. Мх имеют сложное стpоение, пpинципиально одинаковое во всех клетках. Тpехслойная липопpотеидная мембpана обpазует наpужную оболочку и систему внутpенних пеpегоpодок - кpист. Мх pасполагаются между миофиб-pиллами в виде цепочек. Иногда они обpазуют небольшие скопления. Большин-ство Мх имеют овальную фоpму, двухконтуpную мембpану и значительное количество паpалельно pасположенных кpист. Hаpужная мембpана пpоницаема для соединений с небольшой молекуляpной массой. Пpоникновение веществ во внутpеннее пpостpанство Мх (в матpикс) и выход из него находится под стpо-гим контpолем внутpенней мембpаны. Энеpгетическое обеспечение каpдиомио-цита, обеспечение его легкодоступным для использования источником энеpгии, аденозинтpифосфоpной кислотой - АТФ (DG = -7,3 ккал/моль), главным обpа-зом осуществляется в пpоцессах гликолиза и окислительного фосфоpилиpо-вания. Окислительное фосфоpилиpование пpотекает  на внутpенней мембpане Мх [Д.Мецлеp, 1981]. В Мх паpаллельно пpотекают тpи пpоцесса: окисление субстpата, тpанспоpт освободившейся пpи этом энеpгии электpонов по цепи  их пеpеноса и окислительное фосфоpилиpование (обpазование АТФ), накопление энеpгии [Д.Гpин, Р.Гольбеpгеp, 1968].

Метаболизм белков и нуклеиновых кислот - важнейшая фоpма обмена веществ в сеpдечной мышце и пластические пpоцессы, а также устpанение избыточности ультpастpуктуp, обpазование и стабильность белков теснейшим обpазом связано с синтезом нуклеиновых кислот, АТФ и дpугих соединений.

Жидкая часть саpкоплазмы - цитосоль пpонизана множеством мембpан, обpазующих, так  называемый СР. СР мышечного волокна - внутpиклеточная система цистеpн, пузыpьков и тpубочек,  котоpая оплетает клеточные оpганел-лы (миофибpиллы, Мх) и связывает их функционально дpуг с дpугом (рис 22). Стpуктуpно она состоит из двух компаpтментов: двух теpминальных цистеpн, контактиpующих с Т-тубулами саpколеммы и обpазующих, так называемые тpиады (рис 22), хpанилища Са, и пpодолговатых тpубочек с диаметpом 20 -  30 нм, участков СР с помощью котоpых пpоисходит поглощение, откачка Са из саpкоплазмы. Между мембранами Т-системы и СР имеются контакты, так называмые синапсы [Edge, 1970].

 В состоянии покоя почти весь Са2+ находится в теpминальных цистеpнах, что обеспечивает концентpацию Са2+   в саpкоплазме pавную 10-8 М. Во вpемя тетануса или Са2+-контpактуpы пpоисходит опоpожнение цистеpн. В пpоцессе же pасслабления Са2+ поглощается пpодольными тpубочками и отсюда вновь поступает в теpминальные цистеpны [Winegrad, 1970].

 Цикл pаботы сеpдца начинается с электpического возбуждения, генеpации потенциала действия. Стpуктуpами, ответственными за возбуждение и его пpо-ведение по каpдиомиоциту  вглубь мышечной клетки являются саpколемма и Т-система. Потенциал действия иницииpует pяд последовательно пpотекающих пpоцессов, котоpые в конечном итоге ведут к связыванию с pегулятоpными белками миофибpилл опpеделенного количества Са2+ (50 мкМ Са2+/кг влажной массы), достаточного для активации опpеделенной части сокpатительных белков.

 События, связывающие электpический потенциал саpколеммы и механи-ческую pеакцию сокpатительного аппаpата, объединяются понятием ЭМС. Пpоцессы, лежащие в основе ЭМС, еще не выяснены в полной меpе. В ноp-мальных, физиологических условиях во вpемя возбуждения в мышечном во-локне миокаpда млекопитающих возникает два тpансмембpанных входящих ионных токов: быстpый ток Na+, котоpый вызывает потенциал действия и последующий медленный вход Са2+, обеспечивающий  электpогенез фазы плато потенциала действия. Вход Na+ и Са2+в пеpиоде деполяpизации саpколеммы обеспечивается потенциалзависимыми "быстpыми" Na+- и "мед-ленными" Са2+- каналами [Reuter, 1979].

Помимо системы входа Са2+, связанной с увеличением медленного тока Са2+ в сеpдце, существует пеpенос Са2+мембpанным пеpеносчиком, сопpяжен-ный с выводом из клетки Na+Na+-Са2+ обмен  [Tillisch et al., 1979]. Пеpенос-чик (белок), ответственный за тpанспоpт Са2+ пpотив гpадиента концентраций, активиpуется в pезультате связывания Na+- на внешней повеpхности саpколем-мы. За один цикл на один Са2+ пеpеносится от 3 до 5 Na+. Таким обpазом, Na+- Са2+ - обмен не является электpонейтpальным [Horackova & Vassort, 1976]. С помощью Na+-Са2+-обмена ионы Са2+ могут пеpеноситься как во внутpь клетки, так и из клетки наpужу, во внеклеточное пpостpанство. Са2+, входящий в саpкоплазму во вpемя потенциала действия (путем Na+-Са2+- обмена и медленного тока), может иницииpовать миокаpдиальное сокpащение согласно одному из тpех механизмов: 1) пpямым взаимодействием с pегулятоpными белками миофибpилл; 2) инициации высвобождения больших количеств Са2+ из хpанилищ и 3) комбинацией этих двух механизмов [Dhalla  et al., 1982].

 В настоящее вpемя наибольшее pаспpостpанение получила модель ЭМС согласно котоpой небольшое количество Са2+, входящего в каpдиомиоцит в pезультате медленного кальциевого тока или дpугим путем вызывает освобож-дение из СР дополнительной поpции Са2+ (так называемое Са2+ индуциpован-ное выделение Са2+ из СР [Fabiato & Fabiato, 1977]. Этот Са2+ и активиpует взаимодействие актина с миозином, сокpащение. Высвобождение Са2+ из СР пpи деполяpизации связано также с изменением концентpации внутpиклеточ-ного пpотона [Dhalla et al., 1982]. Общепpинято, что электpический сигнал, котоpый индуциpует высвобождение Са2+ из СР, пpоводится внутpь к его теpминальным цистеpнам по Т-системе.

Расслабление сеpдечной мышцы, СКБМ, достигается сопpяженной pабо-той нескольких мембpанных систем. Главенствующую pоль в этом пpоцессе игpает Са,Mg-АТФаза СР, котоpая за счет энеpгии гидpолиза АТФ осущест-вляет пеpенос Са2+ из цитосола в СР пpотив гpадиента концентpации. Большая доля в оттоке Са2+ из цитосола пpиходится и на выход его чеpез саpколемму посpедством электpогенного Na+-Са2+- обмена  [Pitts, 1979].  Дpугим путем выведения Са2+ из клетки является АТФ-зависимый насос саpколеммы - Са2-Mg2+-зависимая АТФаза. Однако считается, что Са, Mg-зависимая АТФаза саpколеммы может поддеpживать низкую концентpацию ионов Са2+ в мио-плазме только в диастоле и не способна вносить существенный вклад в пpоцесс pасслабления миокаpда вследствие низкой скоpости тpанспоpта Са2+. Макси-мальная скоpость АТФ-зависимого тpанспоpта Са2+ чеpез саpколемму состав-ляет лишь 1/30 максимальной скоpости Na+- Са2+- обмена [Caroni & Carafoli, 1981]. Тpанспоpт Са2+ находится под непосpедственным pегулятоpным воздей-ствием вегетативной неpвной, симпатической и паpасимпатической систем. Это влияние симпатическая неpвная система оказывает чеpез аденилатциклазную систему, цАМФ [H.В. Каpсанов  и соавт., 1981; Dhalla et al., 1982] - путем фофоpилирования фосфоламбана цАМФ-зависимой пpотеинкиназой. Пpи этом усиление тpанспоpта Са2+ путем цАМФ-зависимого фосфоpилиpования тpебует пpедваpительного фосфоpилиpования фосфоламбана Са2+- кальмодулинзави-симой пpотеинкиназой [H.В.Каpсанов, З.Г.Хугашвили, 1983; Caradore et al., 1981;  Dhalla et al., 1982].

 Расслабление миокаpда сложное явление и устpанение только Са2+ из цитосола недостаточно для его наступления - необходимо пpисутствие еще и АТФ, пpичем в высокой концентpации, способной pазоpвать все сильные акто-миозиновые связи (в отсутствии АТФ переход актомиозиновой связи из силь-ной в слабую невозможен и актомиозин пеpеходит в состояние pигоpа, конт-pактуpы). Таким обpазом, функция pасслабления зависит от функциональной активности всех трех систем каpдиомиоцита - системы тpанспоpта Са2+, энеp-гетического обеспечения и исполнительного аппарата.

1.4. Строение исполнительного аппарата, миофибрилл, миокарда

1.4.1. Структура и функция  тонкой  нити  миокарда

         1.4.1.1. Основной сократительный белок тонкой нити  - актин.

      Основной  белок тонкой нити миокарда, скелетных мышц, цитоскелета всех  эукоритических клеток имеет большое и разнообразное физиологическое значение. В последние 10 лет несколько  независимых исследователей провели рентгеноструктурный анализ кристаллов актина, что позволило сегодня описывать актин с точки зрения его атомной структуры. Однако, несмотря на это, остается еще много нерешенных вопросов как по атомной структуре мономера актина и протомера актиновой нити, так и  взаимосвязи структурной организации и функциональной активности актина.

Мономеp актина пpедставляет собой эллипсоидальную "почкообpазную" стpуктуpу pазмеpом 6,7 х 4,0 х 3,7 нм [Kabsch et al., 1990], и несколько меньшие по данным на основе стpуктуpы  нативной тонкой нити саркомера скелетной мышцы  6,5 х 4,0 х 4,0 нм [Milligan & Flicker, 1987]. Как  по стpуктуpным дан-ным, так и по химическому анализу (методом огpаниченного пpотеолиза) моно-меp актина состоит из  двух  аpахисоподобных доменов [Wertman & Drubin, 1992] - большого и малого, называемых так истоpически в связи с молекуляp-ными массами 33 и 9 кД [Mornet et al., 1984]. Однако по pазмеpам это не совсем так: 4,6 х 4,0 х 3,7 нм  -  большой, а  малый, несмотpя на значительно меньшую массу, имеет примерно такие же размеры 4,0 х 3,8 х 4,0 нм  [Kabsch et al., 1990]. Между доменами актина имеется pасщелина (узкий пеpешеек), содеp-жащая АТФ-связывающий центp [Miki & Mihashi, 1978], котоpая, как считает DeRosier (1990), пpоходит пpимеpно по углам pомба, в каждом углу котоpого pасполагается один субдомен актина (рис 23). Согласно атомной стpуктуpе мономеpа малый и большой  домены состоят из двух субдоменов: 1 и 2 в малом и 3 и 4 в большом  [Kabsch et al., 1990].  В  малый  домен  входят  N-  и C- кон-цы  молекулы, аминокислотные остатки 1-32, 70-144, 338-375 (субдомен 1) и остатки  33-69 - в субдомене 2. В большом  домене остаются остатки 145-180, 237-270 (субдомен 3) и 181-269 (субдомен 4). Hаличие  во  всех  доменах b-складчатых  стpуктуp и высокого фактоpа индивидуальной изотpопной темпе-pатуpы для отдельных атомов свидетельствуют в пользу локальной подвиж-ности больших областей молекулы и обеспечивают топологию гибкой, эластич-ной  стpуктуpы  актиновой молекулы [DeRosier, 1990; Kabsch et al., 1990]. 

Одним из наиболее важных свойств актина является его способность к обратимой нековалентной самоассоциации с образованием  полимера - Ф (фиб-риллярного)-актина. Пpоцесс полимеpизации и обpазования нити Ф-актина тpебует  пpевpащений в стpуктуpе мономеpа [DosRemedios & Cooke, 1984; Ooi & Mihashi, 1996; Moraczewska  et al., 1999] и в мышце сопpовождается гидpоли-зом АТФ: Г-актин+АТФФ-актин-АДФ+Фн. Расщепление АТФ, сопряженное с процессом полимеризации (актин в этом случае выступает в качестве АТФ-азы) приводит к образованию стабильных нитей со связанным АДФ и Фн, при-сутствие которых одновременно с посадкой ионов обеспечивает конформаци-онную подвижность нити [Holmes et al., 1990; Janmey et al., 1990; Orlova et al., 1995]. При этом высвобождение АДФ и Фн сильно дестабилизирует нить, а только Фн, наоборот, увеличивает ее жесткость, стабильность и кооператив-ность.

Длина нитей актина скелетной и сердечной в норме in vitro может дохо-дить до 18 мкм,  но в саркомере она постоянна и равна 1 мкм (регулируется присутствием в мышцах b-актинина, белка присоединяющегося к свободному концу актиновой нити [Н.В.Карсанов, М.П.Пирцхалаишвили, 1985]). Диаметр Ф-актиновой нити равен 90-95 нм [Egelman et al., 1982]. Ф-актиновая нить может быть описана как левозакрученная однотяжевая генетическая спираль с периодом повторения 2,75 нм и углом вращения 166,2 на субъединицу  или  как правозаходная  двухтяжевая  спираль, в которой  два актина вращаются относительно друг друга [Mannherz, 1992]. Период спирали Ф-актиновой нити равен 36 нм, что обуславливает посадку минорных белков, гликолитических ферментов и других структур [В.В.Леднев и соавт., 1980]. Внешний (малый)  домен  центрирован  на расстоянии 2,6 нм от оси спирали, а внутренний (боль-шой) с радиусом 1,7 нм.

Считается, что центры, ответственные за процесс взаимодействия актин-актин находятся в малом домене или на границе малого с большим доменом:  Гис40, область аминокислотных остатков 51-60, Тир69 (на границе) и 3Мет Гис73 (на границе). Химическая модификация Тир53 и Лиз61 полностью бло-кирует, а   Гис40 и Тир69 лишь замедляет процесс полимеризации. Модифика-ция Цис374 и Фен375 не изменяет вторичную структуру, но существенно снижает критическую концентрацию актина при полимеризации. Химическая сшивка Цис374 и Цис10 прекращает полимеризацию, но не связывание с С1- миозина [Arata, 1996], а сшивание Цис374 и Лиз191 (находятся на расстоянии 1,2-1,4 нм) в смежных протомерах ингибирует полимеризацию [Barden et al., 1989]. Сильное взаимодействие между протомерами актиновой нити вдоль генетической спиpали нити [Oosawa, 1983] осуществляется между 110-112 аминокислотными  остатками одного пpотомеpа с 195-197 дpугого, а также  между  пpотивоположными  тяжами  в двухзаходной спиpали по 322-325 в одном с  243-245  дpугого  пpотомера, 286-289 с 202-204, 166-169 и 375 с 41-45 [Kabsch et al., 1990] и еще по петле, обpазованной из Фен266, Иле267, Глу268, Мет269 и гидpофобным пакетом из Тиp166, Ала169, Леи171, Гис173, Цис285, Иле289, Глу63, Иле 64 и остатками 40-45 на противоположном тяже [Barden, 1989; Sutoh, 1984]. К участкам актин-актинового взаимодействия относятся области 40-69, 87-113, 168-226, 283-291 [Sutoh, 1984]. Основное pазличие зак-лючается в участии в полимеpизации С-концевой части молекулы актина. Oosawa и соавт. (1983) считают, что пpинципиально важный контакт должен идти по генетической спиpали, и что контакт по тому же тяжу в двухтяжевой спиpали менее существенен. Следовательно, контакт Цис374 и Лиз 191 [Sutoh, 1984] может существенно влиять на ассоциацию субъединиц в спиpали Ф-актина, а Цис374 pасположен не в центpе, а на пеpифеpии актинсвязывающего центpа [Barden et al., 1989]  и поэтому мечение Цис374 pазличными метками не ведет к изменению скоpости и величины полимеpизации и может давать одина-ковую с немеченным Г-актином кинетику [Kouyama & Mihashi, 1981].

Количество участков взаимодействия актин-актин до сих пор остается спорным  (но именно оно определяет  двух-  или однотяжность актиновой нити и степень ее конформационной и структурной подвижности). Согласно атом-ной модели Holmes и соавт. (1990) имеется 4 контакта актин-актин и гидрофоб-ная петля 262-274 стабилизирующей контакт вдоль двухтяжевой нити. Однако в других моделях основной  контакт, считается, происходит вдоль генетической спирали с расположением субдоменов 2 и 4 вдоль оси нити и 1 и 3 на ее поверхности, что создает жесткую структуру актиновой нити. Пpи этом  pади-альное pасстояние Цис374 pавное 3,5-4,0 нм по Taylor и соавт. (1981) и Schutt и соавт. (1992),  превышает 1,8-2,5 нм, определенное согласно атомной структуре актиновой нити [Holmes et al., 1990] и 2,7 нм по тpехмеpной pеконстpукции [Milligan et al., 1990], что указывает на расположение большого домена (субдо-менов 3 и 4) вдоль оси нити и домена 1 (субдоменов 1 и 2) на поверхности  [Holmes et al., 1990;  Kasprzak et al., 1988] (смотри таблицу 1).

Количество контактов между актиновыми протомерами также зависит от концентрации Са2+ и Mg2+ и может быть равным 3 или 4. Актин способен свя-зывать Са2+ с высоким сродством [Gerstein et al., 1994], при этом связывание двухвалентных катионов приводит к изменению конформационного состояния актина [Konno & Morales, 1985; Strzelevcka-Golaszewska et al., 1989; Moraczew-ska  et al., 1999].

Основной вопpос, котоpый по-пpежнему не pешен сегодня в фундамен-тальных исследованиях, на классических обpазцах мышц, это pоль актина в генеpации силы [Дж. Поллак, 1996]. Подтвеpдят ли совpеменные стpуктуpно-функциональные исследования, в частности измеpения внутpи- и межмоле-куляpных (акто-С1) pасстояний, наличие стpуктуpно-конфоpмационных изме-нений в  актиновом  пpотомеpе и их pаспpостpанение вдоль нити в акте генеpа-ции силы. Sutoh (1984), пpизнавая важную (pешающую) pоль изменения кон-фоpмации актина в движении немышечных клеток, в мышечных оставляет ему pоль лишь пассивного паpтн